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双钩异翅长蠹检疫鉴定方法 Detection and identification of Heterobostrychus aequalis (Waterhouse) （送审稿2013.11.24） 前 言 本标准依照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T 1821-2006《双钩异翅长蠹检疫鉴定方法》，与SN/T 1821-2006相比，主要技术变化如下： ——在前言中增加了标准涉及专利的相关说明。 ——增加了规范性引用文件。 ——增加了RDB术语定义。 ——修改了目次的编排格式。 ——增加了双钩异翅长蠹的反向斑点杂交（RDB）检疫鉴定方法。 ——增加了资料性附录A 双钩异翅长蠹的RDB通用引物SF/SR、阳性质控质粒及探针序列规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 RDB Reverse dot blot 反向斑点杂交，一种基于PCR基础之上的杂交技术基本信息学名：分类地位：。 全世界已知种，种棕异翅长蠹Brunneus (Murray)；二突长蠹hamatipennis (Lesne)；直角异翅长蠹H.pileatus (Lesne)；额瘤异翅长蠹H.unicornis (Waterhouse)和Heterobostrychus ambigenus (Lesne)。双钩异翅长蠹的附录A。形态特征判定。生物素标记的PCR产物；再与预先人工固化在EDC活化的尼龙膜（或硝酸纤维膜）上的特异性寡核苷酸探针杂交，通过肉眼观察RDB膜条上对应探针位点的显色反应进行结果判定。 6 仪器、用具和试剂 6.1 仪器和用具 6.1.1 形态学方法 体视显微镜、锯、刀、镊子、标签、解剖针、解剖刀、白塑料布、毛刷、指形管、养虫箱。 6.1.2 RDB方法 高压灭菌锅、振荡水浴锅PCR仪离心机微量加样器旋涡器针式打印机μL）、滤纸等。 6.2 试剂 6.2.1 形态学方法 75%乙醇、0.5%～ 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。液氮、昆虫基因组 DNA 提取试剂盒、PCR缓冲液、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、Taq DNA聚合酶、1-乙基-3[3-（二甲氨基）丙基]碳二亚胺（EDC）、EDC 尼龙膜（或硝酸纤维膜）、TE缓冲液、20×标准柠檬酸盐（SSC）、pH7.0，10%十二烷基磺酸钠（SDS）、柠檬酸钠、链霉抗生物素蛋白-辣根过氧物酶结合（POD）、四甲基联苯胺（TMB）、30%双氧水、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠。 7 实验室检疫 7.1 表面检查 检查木材、竹材、藤材或其制品、包装材料以及运输工具的表面是否有活虫爬行或死虫附着，观察其外表是否有蛀孔和蛀屑。对带皮的木材应剥开树皮观察是否有蛀孔和蛀屑。 7.2 剖材检查 对可疑的或发现蛀孔和蛀屑的木竹藤材要用锯和刀进行剖材检查，检查是否有成虫、幼虫或蛹。观察是否有与材料纵向平行的幼虫取食坑道，坑道直径6.0 mm左右，长可达30.0 cm，深5.0 cm～(20 ℃～30～～～～～～～～～～～ 蛹 体长7.0 mm～取单头虫体或一粒卵（低温保存于无水乙醇中），用去离子水冲洗数遍放在干净滤纸上晾干。检测 通用引物、阳性质控质粒及探针通用引物、阳性质控质粒及探针杂交试剂的配制 RDB膜的制备 用针式打印机在硝酸纤维膜）上打印出来探针稀释，用探针稀释缓冲液定容到200 μmol/L，稀释到20 μmol/L用配制32EDC溶液，现用现配20 μmol/L探针与32 ％ EDC等体积混合，按设计好的点膜矩阵手工点膜，0.5 μL/点，空白对照用32 % EDC和/碳酸氢钠按1：1的比例配置室温放置2 h，或60 ℃20 min。膜用0.1 mol/L 处理10 min水洗4次，每次5 min60 ℃，20 min烘干膜条，4 ℃保存。PCR 通用引物SF用灭菌去离子水或TE稀释为20 μmol/LSR稀释10 μmol/L待用，使用上下游引物浓度不对等进行PCR扩增。试剂名称 PCR反应体系终浓度 10× PCR缓冲液 2.5 μL Mg2+ 2.5 mmol/L 正向引物和反向引物 SF 4 μmol/L，SR 2 μmol/L Taq酶 1 U DNA模板 10~20 ng H2O至 25 μL PCR反应条件：95、5 min，94、40 s，48、40 s，72、40 s，共40个循环，72、5 min，