进出口食品中β-呋喃果糖酶的测定.docVIP

前 言 本标准的附录A、B均为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：江苏出入境检验检疫局、江苏中谱检测有限公司、秦皇岛出入境检验检疫局 本标准主要起草人： 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 出口蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶的测定 范围 本标准规定了蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶的液相色谱测定方法。 本标准适用于蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶的测定。 方法提要 根据β-呋喃果糖苷酶的特性，在蜂蜜中加入棉子糖作为底物，在一定的温度下反应一段时间后，用液相色谱示差折光检测法(HPLC-RID)测定酶解产物蜜二糖，并进一步确定β-呋喃果糖苷酶的含量。 试剂和材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。 乙腈：色谱纯。 柠檬酸：C6H8O7?H2O。 氢氧化钠。 D-(+)-五水棉子糖（C18H32O16?5H2O）：纯度为98 %。 D-(+)-蜜二糖(C12H22O11)：纯度为99.8 %。 β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase，CAS号：9001-57-4）： U/mg。 1 mol/L的NaOH溶液：称取20 g氢氧化钠，用水溶解并定容至500 mL。 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（pH= 4.5）：称取柠檬酸21 g，加500 mL超纯水溶解，用1 mol/L的NaOH调到pH值4.5，最后定容至1 000 mL。 20 %的D-(+)-五水棉子糖溶液：准确称取20g D-(+)-五水棉子糖，用超纯水溶解定容至100 mL。 标准储备液：准确称取β-呋喃果糖苷酶标准品0.1 g，置于100 m容量瓶中，加入超纯水溶解并定容至刻度，配成 mg/mL溶液，于0 ℃-4 ℃保存。 标准中间溶液：吸取1 m 标准储备液置于100 m的容量瓶中，加入超纯水定容至刻度，配成0.01 mg/mL溶液，于0 ℃-4 ℃保存。聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶微球，粒径45～90 μm，分级分离的相对分子质量范围100～1 800。 注：可使用Bio-Gel? P-2 型聚丙烯酰胺凝胶或同等性能的凝胶材料。 凝胶层析柱：将聚丙烯酰胺凝胶装入1.5 cm×15 cm空柱管中，装入的凝胶高度为10 cm，上端保持1 cm以上的水层，避免干涸。 滤膜：0.45 μm，水相。仪器和设备 高效液相色谱仪，配示差折光检测器。 天平：感量为0.01g。 涡旋混合器。 PH计。 超纯水器。 恒温水浴振荡器。 具塞塑料离心管:50 mL 试样制备和保存 5.1 试样制备 取500 g代表性蜂蜜样品，未结晶的样品将其用力搅拌均匀，有结晶析出的样品可将瓶盖塞紧后，置于不超过60 ℃的水浴中温热，等样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。在融化时应注意防止水分挥发，制备好的试样均分成两份，分别装入样品瓶中，密封，并明标记。 5.2 试样保存 试样于室温下保存。 在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 测定步骤 提取 称取2.0 g(±0.05 g)蜂蜜样品，加入水溶解并定容到10 mL，混合均匀后过0.45 μm的滤膜（3.）至10 mL试管中，待净化。 净化 将准备好的聚丙烯酰胺凝胶层析柱（3..2）中的水放尽，至下端无水珠滴下时，将样品滤液（6.1）5.0 mL沿柱壁慢慢加入层析柱中，恰好流至凝胶上方无液时，加入3.0 mL超纯水冲洗，又至凝胶上方无液时，加入5.0 mL超纯水，同时收集流出液，溶液收集于50 mL塑料离心管（4.7）中，待酶解。注意每次在层析柱上方加液的时机，应该是前次加的液体在凝胶上端流尽、下端恰好无液体滴出。聚丙烯酰胺凝胶层析柱用50 mL超纯水冲洗，至全部流出后，该柱直接用于处理下一个样品。 酶解 6.3.1 于收集的样品溶液中加入2 mL20 %的D-(+)-五水棉子糖溶液（3.），然后加入柠檬酸缓冲液（3.）并定容至10 mL。 6.3.2 摇匀后放入50 ℃恒温水浴振荡器中反应16小时。 6.3.3 反应结束后将上述溶液吸出，过水系0.45 μm的滤膜（3.），待进样检测。 标准工作溶液的配制 6.4.1 取6个干净塑料离心管（4.7）进行编号并于离心管中分别加入9 μL 、18 μL、45 μL、90 μL、180 μL、450 μL的0.01 mg/mLβ-呋喃果糖苷酶溶液（3.1）在每个离心管中加入2 mL的20 %的D-(+)-五水棉子糖溶液（3.），然后用柠檬酸缓冲液（3.）定容至10 mL。 6.4.2 按照步骤6.3.2和6.3.3进行处理。 测定 色谱条件 a) 色谱柱：Carbohydrate 5μm，4.6*150 mm，或相当者； b) 柱温：35 ℃； c) 进样量