人参classIII几丁质酶Gchi1基因克隆及原核表达分析.pdfVIP

农业与技术 第 33 卷 第 12 期 2013 年 12 月 人参 classIII 几丁质酶 Gchi1 基因克隆及原核表达分析 王南，董园园，姚娜，刘秀明，王法微，李海燕 * ( 吉林农业大学 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心 , 吉林 长春 130118） 摘 要 ：几丁质（N- 乙酰氨基葡萄糖线性聚物）是病原真菌细胞壁的主要成分，几丁质酶通过破坏细胞新物质的沉积，激发寄主植 物的抗病反应，使病原真菌细胞壁中的几丁质降解。植物几丁质酶具有广泛的生理活性。几丁质的酶基因工程成为目前抗真菌基因 工程研究热点之一。本研究通过几丁质酶基因的克隆，构建原核表达载体 pET-28a(+)-GchiI，利用 IPTG 诱导表达，经 PAGE 分析 表明，该基因表达的蛋白分子量为 34kD 左右，其表达产物主要以包涵体的形式存在。抑菌圈试验发现，IPTG 浓度为 0.6mmol/L 时 抑菌效果最佳。本研究对利用基因工程技术培育抗病作物品种，提高作物抗病性具有重要参考价值。 关键词 ：人参；几丁质酶；基因；分析 中图分类号 ：S567.51 文献标识码 ：A 1 前言 对 pET-28a(+) 质粒进行双酶切，然后进行去磷酸化处理，构 几丁质（N- 乙酰氨基葡萄糖线性聚物）是病原真菌细胞 建重组载体 pET-28a(+)-Gchi1。将此重组载体转化感受态大肠 壁的主要成分，几丁质酶通过破坏病原真菌菌丝尖端新合成的 杆菌，筛选阳性克隆并进行 PCR 及酶切鉴定，将鉴定后质粒 几丁质，使病原真菌细胞壁中的几丁质降解；破坏细胞新物质 送至上海生工公司完成测序鉴定。 的沉积，致使病原体死亡，且所产生的细胞壁碎片具有诱导作 2.2.3 目的蛋白的诱导表达及检测 用，可激发寄主植物的抗病反应 [1] 。植物几丁质酶具有广泛的 将含有表达载体 pET-28a(+)-GchiI 的大肠杆菌振荡培养至 生理活性 [2] ，尤其在植物抗病方面具有重要作用 [3] 。 OD600=0.6 时，加入终浓度分别为 0.4、0.6、0.8 和 1.0 mM/L 的 研究发现几丁质酶参与植物的发育调控：植物几丁质酶基因 IPTG。30℃，200 rpm/min 振荡培养，诱导表达 5h 后，离心收 的表达具有组织特异性，参与了植物的发育调控。如几丁质酶参 集菌体，菌体以含 0.2mg/ml 溶菌酶和 10 mM DTT 的磷酸钠缓 与了胡萝卜和云衫的体胚发育过程。几丁质参与共生作用：几丁 冲液 (20 mM， pH 7.2 ) 悬浮，反复冻融 4 次，以超声波破碎后 质酶可以降解固氮菌的结瘤因子，Minic 等研究苜蓿中的几丁质 的样品离心，收集上清液进行 PAGE 检测。 酶对某些结瘤因子具有降解作用。所以几丁质酶通过控制结瘤因 2.2.4 目的蛋白活性鉴定 子水平来使植物与根瘤菌达到共生平衡，而不产生过量的根瘤。 目的蛋白对真菌的抑制采用透明圈法测定，将锈腐菌接种 此外，几丁质酶对结瘤因子的降解具有专化性，可能是决定根瘤 到 PDA 培养基，使其在 25℃下生长 1 周左右。用直径 1cm 沾 菌的寄主专化性的因素之一 [5] 。本研究旨在通过构建几丁质酶表 有上清液的滤纸放到菌丝边缘，以沾有无菌水的滤纸为对照， 达载体制备几丁质酶，用于抗真菌等方面的相关研究。 一周之后观察生长情况。以平板上菌落周围抑菌圈的有无和大 2 材料与方法 小确定菌株是否诱导表达几丁质酶，以及所产几丁质酶的活性。 2.1 实验材料 3 结果 人参由吉林农