Fn对模拟性牙本质形成过程中矿化影响的实验研究.pdfVIP

中文 摘 要 厂 前 言 呀 牙本质是一种高度矿化的结缔组织。在牙本质发生期间，成 牙本巅 细胞首先合成前期牙本质，以胶原性基质为特征，然后矿物 晶体在离细胞一定距离处沉积。经大量研究发现，细胞外基质 (extracellularmatrix,ECM)在矿化过程中起着重要的调控作用。 纤维粘连蛋白(fibronectin,Fn)是一种分布广泛的ECM糖蛋白，其 在牙做生物学领域占有不可忽视的地位，如在牙齿形态发生、促进 间质细胞分化、维持成牙本质细胞功能及盖谧切髓术后的组织修 复过程中都起着重要作用 一些研究发现纤维粘连蛋白与矿 化过程也存在密切关系 本实验在国内首次应用体外矿化系统模 拟牙本质形成过程，并结合微观形态学观察，分别研究有无经基磷 灰石(hydroxyapatite,HAP)晶核时纤维粘连蛋白对钙磷沉积的影 响及其对经基磷灰石的孵育作用，以探讨Fn在牙本质的生物矿化 过程中的作用机制，为纤维粘连蛋白复合经基磷灰石盖髓剂的开 发应用提供理论依据。 材 料 与 方 法 实验采用了微孔板体外凝胶矿化系统。配制凝胶溶液(内 含 0.15M抓化钠，0.0lM磷酸氢二钠，0.05MHepes,0.5%琼脂 糖 ,PH值为7.40)，煮沸后水浴维持4590。实验分两组进行:一组 是无HAP晶核Fn影响组，即向凝胶溶液中加人Fn(Fn浓度分别 为0,50,100,150,200w盯rd);另一组是有HAP晶核Fn影响组， 即凝胶溶液先与HAP粉末混合(使RAP浓度为0.5mg/ml)后，再 加人Fn(Fn浓度分别为。,50,100,150,200/ml)。其中HAP及 Fn浓度为0时作为空白对照组。以上各组溶液在振荡器上混匀 ·1· 后，立即铺于%孔板上，每组铺8个孔，每孔100闪。待成胶后，用 8导加样器向每组的前6个孔中加人150闪钙溶液(内含0.15M 舰化钠，0.0lM抓化钙，。.05MHepes,PH值为7.40)，后两个孔加 人150讨双蒸水。将微孔板在3790孵育4小时后，测量405nm吸 光度值。实验在相同条件下重复三次，整理数据，用ANOVA法进 行统计。以上实验结束后，各组取部分凝胶千燥，用HITACHIS- 450扫描电镜观察沉淀的徽观形态。 Fn对HAP的孵育作用参照Daculsi等的方法，HAP(0.1g)分 别在PBS和含lmg/mlFn的PBS中孵育，室温下两小时后，离心、 弃上清、加人固定液,4℃保持两小时以上。常规包埋、切片，HI- TACHIH一600透射电镜观察。 结 果 1.Fn对凝胶体系中钙磷沉积的影响 本实脸中凝胶吸光度值的增加反映了磷酸钙沉淀A的增多。 由结果可见，随粉Fn浓度的升高，吸光度值也升高，表明Fn有促 进凝胶中钙碑沉积的作用(P0.05)，凝胶中加人HAP 并不影响 Fn的促沉积活性。 2.凝胶中所得沉淀的扫描电镜观察 空白组:沉淀散在分布，呈小顺粒状。 无HAP晶核Fn形响组:沉淀大部分呈不规则网状分布，有的 甚至汇集成团状。 有sIAP晶核Fn形响组河见AHP顺粒上胶联成网的沉淀几 乎完全砚盖HAP报粒。 3.Fn对HAP娜育作用的透射电镜观察 未经Fn解育的HAP最大小均匀一致的圆或椭圆形团块。而 经过Fn解育后HAP失去旅来的形态，变为分散的细小孩粒或大 片的网状。 讨 论 牙本质的生物矿化是一个复杂的生化过程，至今对其具体过 程及调控机制仍不甚明了。体外矿化实验是在体外模拟体内的生 化环境，直观地研究蛋白质对矿化过程中某些化学反应的影响，为 了解该蛋白在体内矿化过程中所起的作用提供间接的证据。本实 验采用了微孔板体外凝胶系统来模拟牙本质形成过程，其原理是 以琼脂搪凝胶模拟胶原性基质，将磷酸根离子和蛋白固定在凝胶 上与含钙溶液进行反应。实验中pH值恒定，初始钙磷浓度确定。 钙离子缓慢扩散人凝胶，当遇到磷酸根离子时形成沉淀，以凝胶吸 光度值为观测指标来监测沉淀量的多少，反应在微孔板上进行