MicroRNA1423p对结直肠癌生物学行为影响及作用机制初步研究.pdf

英文摘要 MicroRNA-142-3p 对结直肠癌生物学行为的影响及作用机制的初步研究 2 MicroRNA-142-3p 对结直肠癌生物学行为的影响及作用机制的初步研究 中文摘要 MicroRNA-142-3p 对结直肠癌生物学行为的影响及作用 机制的初步研究 中文摘要 目的 MicroRNAs 是重要的基因调控因子，被认为在肿瘤发生过程中起着关键的作用。 本课题组前期芯片研究显示 miR-142-3p 在结直肠癌组织中表达水平显著升高。查阅文 献资料，已有一些研究报道了 miR-142-3p 在肝癌、食管癌等恶性肿瘤中的异常表达， 并与肿瘤恶性生物学行为密切相关。因此，本研究以 miR-142-3p 为研究对象，检测 miR-142-3p 在结直肠癌组织中及一些肠癌细胞株中的表达情况；通过网路数据库及生 物软件，预测 miR-142-3p 可能调控的靶基因；通过双荧光素酶实验、RT-PCR、Western Blot 、免疫组化等方法验证 miR-142-3p 和靶基因间的相互作用关系；构建过表达和基 因沉默载体，在体外和体内试验中探讨miR-142-3p 的表达水平变化对对结直肠癌生物 学行为的影响；并通过对其调控的靶基因参与的信号通路的分析研究，探讨 miR-142-3p 对结直肠癌发生、发展、转移的调控机制。 方法 1. Real-time RT-PCR 方法检测 miR-142-3p 在 60 例结直肠癌组织及 3 种结肠癌细 胞株中的表达情况；结果与这些组织样本的的临床病理特征进行分析。 2. 以 miR-142-3p 中等表达的人肠癌 SW480 细胞株为研究对象，应用三种生物 信息学软件和在线网络数据库对 miR-142-3p 的靶基因进行预测，分析结合位点；构 建 miR-142-3p 正义表达载体和靶基因 3‘UTR 荧光素酶载体，应用双荧光素酶报告基 因技术分析 miR-142-3p 对靶基因的转录激活活性；通过对靶基因 mRNA、蛋白表达 产物的检测，确定 miR- 142-3p 对靶基因的调控方式；并进一步采用 RT-PCR 、Western Blot 和免疫组化方法检测靶基因在结直肠癌组织细胞及其他肿瘤细胞中的表达情况。 3. 设计并构建 miR-142-3p 过表达载体 pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miRNA-142-3p 和沉默载体 pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miRNA- 142-3p-Silencer，同时设计 miRNA-无 关序列作为阴性对照（negative control，NC ），并构建表达载体；培养 SW480 细胞， 以脂质体法转染细胞，荧光显微镜观察，以最高转染效率和最低细胞死亡率为原则， 优化转染条件，根据优化的条件将 pPG/miR/eGFP/Blasticidin 质粒转染肠癌 SW480 细 I 中文摘要 MicroRNA-142-3p 对结直肠癌生物学行为的影响及作用机制的初步研究 胞；经 Blasticidin 筛选，获得稳定转染表达的单克隆 SW480 细胞；应用 real-time RT-PCR 检测转染效率，并用RT-PCR 和Western Blot 方法检测稳转细胞株靶基因TCF7 的mRNA 及蛋白表达情况，筛选出干预效果最好各组稳转细胞株用于后续实验。 4. 设计空白对照组(Blank 组 ，SW480 细胞株) 、阴性对照组（NC 组， PG/miR/eGFP/Blasticidin-miRNA-NC 质粒转染 的 SW480 细胞）、 正义实验组 （PG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-142-3p 质粒转染 的 SW480 细胞）和反义实验组 （PG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-142-3p-Silencer 质粒转染的 SW480 细胞）为研究对