猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF6基因的克隆及原核表达.pdfVIP

中国动物检疫 2009年第 26卷第 4期 ．—34．． 猪繁殖与●，口平一吸综合征病毒河北地方株 ORF6基 因的克隆及原核表达 王 娇 ’，孙继国’，陈赛娟 ，刘 涛 ，王 坤 ’，赵泽坤 ’ (1．河北农业大学动物科技学院，河北保定 071O01；2．商务部流通产业促进中心，北京 l0007O) 摘 要：从河北沧州分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒，接种Marc一145细胞，经 4代盲传，出现细胞病 变，经鉴定为PRRSV，命名为HB-3(CZ)株。根据GenBank公布的PRRSVJXA1株 ORF6基因的核苷酸序列，设计并合成 一 对特异性引物 (P1／P2)，用RT-PCR方法扩增完整0RF6基因，将扩增产物连接到pGM—T载体并转化克隆茵，阳性重 组质粒PGM-M进行序列测定与分析。后将克隆质粒PGM-M双酶切后连接原核表达载体 pET一32a(+)，在 Rosseta—DE3 中成功获得表达，经Western-b1otting分析表明，表达蛋白与阳性血清发生特异性反应 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；河北分离株；ORF6基因；原核表达 中图分类号：$852．659．6 文献标识码：A 文章编号：1005—944X(2009)04—0034-03 Prdimim~ stl ofpro~ tio ofORF6 ofp． ∞d哪 andl℃冒ra毛0 gyll~ C、，in HB一3(cz)gllnain． WANGJiao，SUN Ji-guo，CHEN Sai-juan2，LIUTao2,WANGKun，ZHAOZe—kun f1．CollegeofAnimalScienceandTechnologe，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding 071001，China； 2．CirculationIndustryPromotionCenteroftheMinistryofCommerce，Beijing100070，China) Ab|血 允 Thefull—lengthofORF6geneencodingtheenvelopeglycoprotein(GP6)ofPRRSV HB-3(cz)strain isolatedfrom CangzhouHeBeiwasamplifiedbyRT—PCRwiht apairofspecificprimers (p1／p2)designedac— cording to hte relevantsequence ofPRRSV JXA1 srtain，and hten cloned into plasmid pGM-T，the recombinant plasmiddesingatedaspGM—M wassubjectedtosequencnigandanalysis．Afteridentificationbyrestrictionendon- cleasedigestion，htegenewassubclonednitoprokaryoticexpressionvectorpET-32a(+)．Therecombniantfusion proteinspET-M were highly expressed ni Escherichia coliBL21．Western-blotting showed htathte recombinant protein could reactwith hteporcinepolyclonalantibody aganistPRRSV． K 期硝II：Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus；HB一3(cz)strani；ORF6gene；prokaryoticex— pression 但鉴于近年朝鲜、巴基斯坦、意大利、 经三轮蚀斑克隆，获得重组杆状病毒 Cel1MOlLife Sci，2000，57 (12)： 荷兰、德国等地多次暴发流行。羽，该亚 rBachisH7HA，为表达及纯化HA蛋 白 1770．1784． 型禽