甲胎蛋白基因甲基化模式对基因表达的影响.pdfVIP

中文摘要 甲胎蛋白基因甲基化模式对基因表达的影响 摘 要 目的：DNA甲基化被认为是反映细胞内DNA转录状 态的重要表遗传学标记。本研究旨在对甲胎蛋白(AFP) 启动子区域及CpG岛区域的甲基化状态与基因转录水平 的相关性进行评估。 方法：1细胞培养：选取人源HepG2肝癌细胞系(株)、 人源SMMC一7721肝癌细胞系(株)及人成纤维细胞，分 别进行传代培养，用于提取DNA及RNA。 2 平：引物设计软件设计RT—PCR引物。Triz01试剂提取细 像分析软件读取分析二维图像，对比AFP表达水平。 3 剂盒提取细胞基因组DNA，溶于TE后．20℃保存备用。 DNA 酶切基因组DNA后进行HS03一修饰，Wizard Purification System纯化除去未反应的HS03一，沉淀过夜 获得MoDNA(Modi矗cativeDNA)，一20℃冰箱保存备用。 4设计引物：使用在线软件(h即：／／塑巡：业i：堑：然／emboss wwW．cgi)设计MSP、BsP引物。 primer3 中文摘要 在不同细胞中甲基化修饰密度：使用MSP引物(包括甲 基化引物及非甲基化引物)扩增MoDNA模板，电泳对比 MSP产物。 6 不同细胞中甲基化修饰位点：使用BSP引物扩增MoDNA 模板，电泳核对产物长度后，回收纯化PCR产物，自动 测序仪测序，对比甲基化修饰位点。． 结果：1细胞形态学观察：肝癌细胞大小不等，排列 紊乱，核浆比例倒置，失去正常的接触抑制，铺满瓶底后 有重叠现象，具有无限增殖能力；正常人成纤维细胞呈梭 形，细胞生长排列为漩涡状。 2RNA的提取：采取去除砒妊酶污染的措施并使用DNA 酶纯化处理RNA，以防止RNA发生降解或含有DNA杂 带，选取符合以下条件样品：OD260／2801．8，甲醛变性胶 电泳可见三条带：28s、18s、5s。 3 处各有一清晰的特异性条带；SMMC．7721细胞45 1bp处 有一模糊的特异性条带，350bp处有一清晰的特异性条带； 而对照人成纤维细胞只在350bp处有一清晰的特异性条 带。片段长度与原设计长度一致。以p—actin作为内参照， 凝胶图像分析软件读取分析二维图像显示，HepG2中AFP 表达量约是SMMC．772l的lO倍，用人成纤维细胞做对 照获得阴性结果，表明实验结果可信具有特异性。 4细胞基因组DNA的提取：本实验要求DNA完整、纯度 中文摘要 较高，能扩增出目的片段区域而不影响酶切及甲基化处 DNA 理，以nHindIII Marker作为参照，所提取 digest DNA大小为23 130bp。 5MSP法检测结果：在启动子区域，HepG2细胞非甲基化 引物在150bp处可见清晰条带，而甲基化引物只见142bp 处较弱的条带，表明其非甲基化程度较高；SMMC．7721 细胞结果与之相反，表明其甲基化程度很高；而人成纤维 细胞均为很弱的片段，表明其为部分甲基化。而在CGIs 基化程度较之低；．成纤维细胞非甲基化程度很高。 6BSP法检测结果：电泳显示以三种细胞MoDNA为模板 进行扩增，均能扩增出目的条带，248bp处及139bp处各 有一清晰的特异性条带，片段长度符合预期长度，测序结 果使用Dssist 2．O软件对比分析可知HepG2的非甲基化修 饰位点发生率较高，SMMC一7721的甲基化程度较之高， 而成纤维细胞甲基化程度整体很高。因此，此部分启动子 检测区域，肝癌细胞甲基化程度高于成纤维细胞两个CG 位点可作为肝癌检测位点，它们分别位于AFP全基因组 的甲基化程度均高于成纤维细胞，表明此区域可能与AFP 基因是否表达存在相关性。 结论：1人AFP基因在肝癌细胞中表达，正常细胞中 不表达；并且AFP基