上西早生柿ETR5基因RNAi植物表达载体构建及遗传转化研究.pdfVIP

n C T ^ ABRICULTURAE 华 北农 学报 ·20l0，25(1)：84—87 BOREJLI-SIHIGIt 上西早生柿 ETR5基因RNAi植物表达 载体构建及遗传转化研究 于丛丛 ，马俊莲 ，宋春丽 ，陈 佳 (1．河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071001；2．河北农业大学 中兽 医学院，河北 定州 073000) 摘要 ：据已测序的上西早生柿ETR5基因序列 ，设计了2对带限制性 内切酶位点的特异性引物 ，以测序质粒为模 板 ，PCR扩增到 2个 ETR5一Uenishiwase基 因片段 。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补 的大片断。连接片断经 双酶切消化后 ，定 向连接到植物表达载体 pSMAK321的35S启动子和 NOS终止子之间，构建成 Uenishiwase—ETR5基 因的RNA干扰植物表达载体 。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转人根癌农杆菌 EHA101中。以上西柿组培 苗叶片为外植体 ，优化遗传转化体系，结果表明：农杆菌重悬液和共培养基中均添加 200~mol／L的As及 Spc梯度筛 选能有效提高转化率 。转化植株经 PCR检测得到7株 阳性植株。 关键词 ：上西早生柿 ；ETR5；RNAi；植物表达载体 ；转基因 中图分类号：Q786 文献标识码 ：A 文章编号：1000～7091(2010)01—0084一O4 UenishiwasePersimmonETR5GeneRNA InterferenceExpressionVector Construction and GeneticTransformation YUCong—cong ，MA Jun—lian ，SONG Chun．1．i．，CHENJia (1．CollegeofFoodScienceandTechnology，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding 071001，China； 2．CollegeofChineseVeterinary，AgriculturalUniversityofHebei，Dingzhou 073000，China) Abstract：Twopairsofpiimerscontainingrestrictionenzymesiteweredesignedandusedtoamplifysequenced plasmid．TwoPCR productsweredigestedbythecorrespondingrestrictedenzymesrespectively，andconnecttobea longreversecomplementary fragment．Thefragmentwasdoubledigestedbycorrespondingenzymesand inserted be— tweenCaMv35SpromoterandNOSterminatorofexpressionvectorpSMAK311．Confirmedbyrestrictionendonucleas— es，theRNAiexpressionvectorwastransformedintoAgrobacteriumtumefaciensstrainEHAIO1byfreezing-thawmeth— od．UsingUenishiwase persimmon invitroplantletleavesasexplant，Agrobacterium—mediatedtransformation system wasoptimized．Theresultsshowedthatadding200p~mol／LofASinbothagrobacterium suspension liquidandculture medium andSpcconcentration gradientscreeningcould increasethefrequencyoftransformation．7strainsoftrans— formedUenishiwasepersimmonplantletswereverifiedbyPCR． Keyw