深圳地区结核分枝杆菌耐药及广泛耐药分离株分子特征研究论文.pdfVIP

检测到90％左右的脊柱结核耐SM分离株。 通过复合PCR-反向斑点杂交技术能同时分析脊柱结核临床分离株的叩sL基因和11rs基因，和单 基因PCR扩增方法比较，简便省时，为进一步研究脊柱结核分枝杆菌对其他药物的耐药性奠定了 基础。从PCR扩增到杂交结果判断仅需2天时间，简便经济、准确快速，对指导临床医生及早准确 用药非常有价值。 深圳地区结核分枝杆菌耐药及广泛 耐药分离株分子特征研究 深圳市慢性病防治中心病原检验科518020 桂静王峰罗道泉汪洪富 彭毅张莉 结核分枝杆菌(Mycobacterium 类传染病之一。中国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二位，仅次于 印度：世界卫生组织(WHO)调查结果显示，1／4的全球每年新发耐多药结核杆菌感染病例分布在中 国。尽管结核病是一种可以治愈的疾病，但在世界范围内，每年仍有2百万人死于结核病，尤其对于 人类免疫缺陷病毒感染者，结核病是其主要死亡原因；高耐药率和耐多种药物结核菌的不断扩散是 引起结核病卷土重来的主要原因。在结核细菌对至少两种最强有力的抗结核药物异烟肼和利福平 具有耐药性时，产生耐多药结核病(MDR．TB)；结核菌对两种或两种以上一线抗结核药发生耐 药，但不包括同时耐异烟肼和利福平时，产生多耐药结核病(PDR．TB)；广泛耐药结核(XDR． TB)是除耐多药结核之外对任何氟喹诺酮类药物以及三种二线注射药物(硫酸卷曲霉素、卡那霉 素和阿米卡星)中至少一种具耐药性的结核病；多重耐药性结核病的暴发流行和高致死率，已成 了全球共同面临的挑战。 近年来，各国学者采用分子生物学技术对结核杆菌耐药机理进行深入研究，认为结核分枝 致；耐链霉素是由于其核糖体蛋白30S亚基S12的编码基因(rpsL)和(或)16SrRNA编码基因(ITS)突 变所致；耐异烟肼可能与过氧化物酶的编码基因(katG)和(或)一种与分枝菌酸生物合成有关的酶 rRNA编码基因(rrs)和16S (gyrA，B)有关；耐卡那霉素分子机制为16S rRNA编码基因(rrs) 与23SrRNA编码基因(rrl)间隔序列突变所致，为耐药结核杆菌耐药性的快速检定和防治提供 了理论基础。我们通过聚合酶链反应(PCR)检测结核分枝杆菌临床分离耐药株的rpoB、katG、 在本地区耐药的分子流行特征，为新的分子药敏试验方法的建立提供实验依据。 材料和方法 一、材料与试剂 MTBI临床分离株(含耐药株及全敏感株)由本实验室临床分离，共123株。药物粉剂纯品异 烟肼、利福平、链霉素、卡那霉素、氧氟沙星均购自美匡iSigma公司；结核分枝杆基因组DNA提 171 取试剂盒购自深圳亚能生物科技有限公司； PCR试剂购白天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker购自深圳依诺金生物科技有限公司；gold．view核酸染料、琼脂糖凝胶购自上海英俊生物科 技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。 二、方法 准，使用L—J药敏培养基，1％比例法药敏试验测定其耐药性，方法参照《结核病诊断细菌学检验 规程》，主要针对5种药物，包括异烟肼、利福平、链霉素、氧氟沙星、卡那霉素，选择药敏表型 稳定菌株作为此次实验研究菌株。结核杆菌毒力标准株H37RV由香港国际分枝杆菌参比实验室提 供，为试验质控用标准结核分枝杆菌。 操作。 5．0软件设计，送上海英俊生物工程 法。各靶基因PCR引物序列参照文献【3．6】，采用primerpremier Buffer l(10 有限公司合成，具体见表l。PCR反应体系为25山：10XTaq2．5山，primerpmol／Ial) DNA 2．5山，primer2(10pmol／山)2．5山，TaqPolymerase(2．5U／山)0．4山，dNTPmixture(2．5mM)2 mi