永生化骨髓间充质干细胞克隆形成能力和致瘤性的实验研究.pdfVIP

山东医药2010年第 5O卷第3期 永生化骨髓间充质干细胞克隆形成能力 和致瘤性的实验研究 白彦东 。李永梅 。田学忠 ，白志津 (1天津市人民医院，天津300120；2天津医科大学内分泌研究所) 摘要：目的 探讨永生化人骨髓间充质干细胞(hBMSC)用于软骨组织工程的可能性及安全性。方法 自健康 志愿者骨髓中提取原代 hBMSC，流式细胞仪检测表型后建立永生化hBMSC，将 hBMSC及永生化 hBMSC细胞悬液 接种于双层软琼脂培养基中，2周后观察克隆形态并计算克隆形成率；将两种细胞接种于裸鼠背部皮下，术后3d 及 1、3个月肉眼观察成瘤情况。结果 hMSC表面抗原 CD CD45表达阴性，CD扮、CD7l、CD。06表达阳性；hBMSC未 能在软琼脂中形成克隆，永生化hBMSC克隆形成率为0．3％；永生化hBMSC接种裸鼠后3d接种部位有细胞聚集 的团块，1、3个月时均未见肿瘤形成。结论 本研究通过转基因技术建立的永生化hBMSC增殖能力较强，但无致 瘤性，可作为种子细胞用于软骨组织工程中。 关键词：间充质干细胞；永生化；致瘤性 ；双层软琼脂实验 中图分类号：1t392-33 文献标志码 ：B 文章编号：1002-266X(2010)03-0046-02 问充质干细胞 (MSC)具有多向分化潜能，是组 方法，将 目的基因转人包装细胞 PT67细胞中，利用 织工程中重要的种子细胞。2007年9月，我们通过 G418筛选阳性克隆，收集并过滤阳性克隆的病毒上 转基因技术建立了永生化MSC，并对其克隆形成能 清。采用密度梯度离心法原代培养hBMSC，FCM单 力及致瘤性进行了观察，旨在评价其增殖能力即在 克隆抗体筛选鉴定纯度。用高滴度的病毒上清感染 组织工程实验中的安全性。现报告如下。 hBMSC，C418筛选 3周后有克隆出现，挑选克隆，并 1 材料与方法 扩大培养，常规冻存、复苏、传代及生物学鉴定，倒置 1．1 材料 选取 1例健康志愿者，无菌条件下抽取 显微镜 ×40观察细胞形态 。 骨髓4ml，6周龄左右裸 鼠(大连医科大学动物中 1．3 克隆形成能力测定 采用第 50代永生化 心)10只；FBS，DMEDM—LG培养液，青霉素、链霉素 hBMSC和第4代hBMSC行软琼脂克隆实验。在6 及二性霉素B；CD29，CD7l，CD06，CD34，CD45单抗；流 孔板制备0．5％琼脂底层凝胶，取对数生长期细胞 式细胞仪 (FCM，BDBiosciense)，相差显微镜 制备成单细胞悬液，按不同密度配成0．35％琼脂培 (BDS020．PH)。CO：培养箱，医用低速离心机。 养基作为上层胶。将培养板移人孵箱，37℃、5％ 1．2 原代人骨髓MSC(hBMSC)培养和鉴定 将健 CO：及饱和温度环境下培养2周。相差显微镜下计 康志愿者骨髓加入 3000U／ml的肝素钠0．1ml肝 算克隆形成数(含有30个以上细胞的集落计为1个 素化，离心去脂肪，用含有 15％ FBS的DMEDM—LG 克隆)。 培养液稀释成细胞悬液，以1．073g／ml的percoU分 1．4 致瘤性测定 取对数生长期永生化hBMSC和 离液离心分离 (400g，20min)，抽取单个核细胞以 hBMSC，用无血清低糖DMEM制备成单细胞悬液后 PBS(pH值7．2)洗2—3次，1200r／rain离心 10 分别无菌接种于5只裸 鼠背部皮下，每个位点注射 min。DMEDM—LG培养液重悬细胞，以2．0×10／cm 细胞2 ×10 ／i／200wl。3d及 1、3个月后分次取 的密度接种于T-25培养瓶中培养。加入青霉素 100 材，肉眼观察成瘤情况。 U／ml，链霉素 100U／ml，两性霉素B0．25g／ml。于 2 结果 37℃、5％CO2的孵箱内培养。72h后更换培养基， 2．1 hBMSC表面抗原鉴定 hBMSC表面抗原 弃掉未