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多酚类植物基因组DNA提取方法的研究 孙志栋陈惠云 (宁波市农科院，宁波315040) 摘要： SDS法和CTAB法是提取植物基因组DNA的两种基本方法。本文以多酚类植物棉花为 P。’—一_c一 研究材料，对SDS法、CTAB法、改莨SDS法和改良CTAB法进行了比较研究，结果表鹳：改进的SDS 法和改进的CTAB法分别优于原SDS法和原CTAB法。两种改进的方法对提取棉花基因组DNA有异曲 同工之妙。DNA的得率不仅与提取方法有关，而且与棉花取材的部位不同有关。改进的CTAB法DNA 得率高于改进的SDS法；棉花不同部位材料采用改进的CTAB法提取基困组DNA，其DNA得率的高 低依次为花药花瓣叶片纤维。由改进方法提取的棉花基因组DNA能完全双酶切，满足SSR和AFLP 等后续分子生物学研究的需要。而且两种改进的方法也适应于其它植物基因组DNA的提取，其中改进 的SDS法尤适于高蛋白、粘多糖类植物基因组DNA的提取，而改进的CTAB法则适于多酚类植物基因 组DNA的提取。 关键词：多酚；垆物；匹匿垂互雯区互淦DNA提取：落§验 。 乙 ／ DNA提取是从事植物分子生物学研究重要技术环节之一。提取的DNA片段大而蛋白质、RNA 及多糖、多酚类物质污染少，是实验结果可靠性和重复性好的保证。棉花是典型的多酚类植物， 其叶片、种子中富含多酚类物质，而纤维中富含多糖类物质，这对高质量提取DNA带来困难。 目前能有效去除植物多糖、酚类化合物和其他杂质的DNA提取方法认为主要有两种：一种 是CsCl密度梯度离心法f1、2】，另一种是CTAB法p、“】。前者由于仪器设各要求较高，且成本高、 费时间，使用受到限制，后者不需要贵重仪器，操作较为简单，能广泛适用于大多数植物的核酸 提取，纯度亦能满足后续分子生物学操作的要求回，应用日趋广泛。棉花的组织器官富含棉酚， 是一类相当活跃的化合物，在植物细胞破碎时易与核酸作用形成稳定的不可逆的复合物¨’7J。因 此，提取高质量的棉花基因组DNA现在似乎更倾向于改进的CTAB法。 获得高纯度的DNA，是AFLP分子标记扩增的关键技术之一。为了筛选出既DNA质量高又 操作方便的棉花基因组DNA提取方法，以保证后续分子生物学的研究，我们以棉花的花药、花 瓣、叶片和纤维等为材料，对DNA提取方法中的SDS法和CTAB法及其相应的改良方法作了反 复试验和比较，并应用到其它植物材料进一步进行验证。结果如下。 1材料和方法 1．1材料 供试材料：棉花叶片、纤维、花瓣和花药等。烟草、芦荟、蚕豆、玉米均取自叶片。螺旋藻 为皿养藻种。 实验试剂：所用试剂均为分析纯，并且除聚乙烯吡咯烷酮(Poly 十二烷基磺酸钠(SodiumDodecyl 20rain。 1．2方法 mmol／LEDTA SDS法提取缓冲液通常为：500mmoI／LNaCI，100mmol／L8，O)，50 Tris-C1(pH KAC。 13-巯基乙醇(用前加入)，20％SDS。另高盐为5mmol／L (pH8)，10mmol／L SDS法根据Clark(1997)”1的方法操作： (1)称取鲜样品29，置于预冷的研钵内(在冰块上操作)，加石英砂少许，快速匀浆，或直 接用液氮磨成粉。 (2)加15ml提取缓冲液，lml20％SDS，混匀65C保温10min，并不时旋转混匀。 (3)加5ml5mol／LKAC，混匀后冰上放置20-30rain。 淀核酸。 (5)20009，4C离心20min，弃上清，晾干沉淀5rain。 50TE缓冲液溶解沉淀并加7p．1RNaseA贮液，37C保温1h。 (6)加700“1 (7)加入75—3moI／LKAC，轻弹混匀，离心15min。 (8)取上清，加500pI异丙醇，轻轻混匀，室温下放置5min。