新生大鼠HIBD时海马区N+F—κB表达和凋亡的研究.pdfVIP

泛珠三角围产医学会议 会议交流 F—KB表达与凋亡的研究 新生大鼠HIBD时海马区N 陈娟 谭玲四川大学华西第二医院 K factorB，NF—K 核因子KB(nuclear B)是一个结构相关的真核生物转录因 子，控制生物及细胞许多基本的生命过程，如免疫和炎症反应、生长发育和细胞凋亡。 F—K F—K 近年来N B在影响细胞凋亡方面的作用逐渐被认识，缺氧缺血后低氧诱导N F—K B活化，进入细胞核内调节凋亡相关基因的表达，调节神经细胞凋亡。但目前N B在缺氧缺血脑损伤后是促进或抑制细胞凋亡及其分子机制，在国内外学术界还存在争 议。本研究拟通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型，探讨海马区NF—KB的表达 与细胞凋亡的关系。 材料与方法 1．材料 其胎龄、体重差异无统计学意义。实验动物由华西实验动物中心提供。 F—KB／P65多克隆抗体购自武汉博士 1．2试剂：TUNEL试剂盒购自美国罗氏公司，N 德公司。 2．方法 手术组(24只)、缺氧缺血模型组(24只)。 等[1]方法制作缺氧缺血性脑损伤模型。SD大鼠经乙醚麻醉后仰卧固定于手术台上，颈 部常规消毒，做颈正中切口游离左侧颈总动脉并双线结扎，剪断线结之间的血管，缝合 皮下组织及皮肤。恢复2小时后置于30。C的缺氧容器中，通入92％N2和8％02混合气体， 取脑组织常规石蜡包埋，切片，HE染色观察神经细胞坏死。 F—KB的表达： 1．3免疫组化法检测N PH6．O的柠 石蜡组织片常规脱蜡至水，3％H202封闭内源性过氧化物酶，置于0．01M F—KB／P65多克隆抗体(1： 檬酸缓冲液中，用微波炉抗原修复15分钟，依次滴加一抗N 一抗作阴性对照：滴加生物素标记的二抗、辣根酶标记的链霉卵白素，DAB稀释液控制 染色、苏木素复染，1％盐酸酒精分化脱色，氨水浸泡还原，梯度酒精脱水，二甲苯透明， 干燥后用中性树脂封片看结果。阳性细胞核呈棕黄色，阴性细胞核呈兰色。 39l 泛珠三角围严医学会议 会议交流 1．4末端脱氧核苷酸转移酶缺口标记法(TUNEL)检测细胞凋亡：， lal 孵育15-30分钟，滴加50TUNEL反应混合溶液，在湿盒中37℃孵育60分钟，PBS洗涤3 u 次，加入50 1转化剂辣根过氧化物酶(POD)，在湿盒中37℃孵育30分钟，PBS洗涤3次， ul-100ul 加入50 DAB底物溶液，室温孵育10分钟，PBS洗涤3次，苏木素复染2分钟， 脱水、透明、封片、看结果。凋亡阳性细胞核呈棕黄色，阴性细胞核呈兰色。 1．5图像采集及统计分析：每张切片用Olympus图像采集系统随机采集四个高倍镜视野 F—KB免疫组化 (10--40)，Image—Proplus专业图像分析软件进行图像分析。测量N 染色阳性细胞数；TUNEL凋亡阳性细胞数。数据用均数±标准差表示，各组均数采用单 F—K 因素方差分析，组间两两比较采用q检验；N B的表达与凋亡的