代谢途径工程菌合成紫杉烯的研究.pdfVIP

代谢途径工程菌合成紫杉烯的研究 王伟朱平程克棣 (中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所) 摘要：目的在大肠杆菌中建立一个能够生物合成紫杉烯(紫杉醇生物合成的第一个重要中间体)的代 作，进而构建了多个融合表达载体。结果为进行代谢途径工程研究，构建了一个在大肠杆菌中以荧 光蛋白为标记的通用基因表达检测载体pHis—EGFP，并检测到用于代谢途径工程的4个重要基因都得 以正常表达。该载体可见的绿色荧光可以直观地观察融合基因表达状况，也使得用亲和层析、离子交 换层析和分子筛层析纯化蛋白更方便易行：在整个蛋白纯化过程中，可以省略每一次纯化所必需的 SDS—PAGE分析，大大地提高了工作效率。为建立紫杉烯生物合成途径，克隆了大肠杆菌的DXP合酶、 IDP异构酶基因及酵母的GGDP合酶基因，构建多个重组质粒，并最终构建成2个融合表达的基因串 合基因的启动子进行了功能表达鉴定，还利用SDS—PAGE分析了每个融合基因的表达情况。完成了2 烯途径的工程菌。 结论构建了一个以荧光蛋白作为报告基因的表达检测系统，4个基因都得以正常表达。在大肠杆菌中 构建了一个能够合成紫杉烯的生物合成途径。 对于自然资源稀少，天然含量很低、分离纯化困难而有机合成又不易产业化的天然药物，如何兼 顾保护环境资源，又能满足人们治疗疾病的需求是一个随着社会的发展而目渐突出并需要尽快解决的 问题。 抗癌药物紫杉醇，抗疟疾的青蒿素及治疗心脑血管疾病的银杏内酯，就属于这样一类药物。因此， 与天然提取和化学合成相比，通过代谢途径工程利用可操作的生物途径之一，如用工程化的酵母生物 合成氢化可的松的成功就展示了这样一个前景，还有通过高表达相关基因来提高类胡萝h素及番茄红 素产量的许多报导…。 紫杉醇是在临床上广泛使用的抗肿瘤药物1，其天然含量很低，在树皮也中只有万分之几到十万 kg的红豆杉树皮 分之几。紫杉烯是紫杉醇生物合成途径的第一个重要中间产物(图1A)，需要750 才能得到纯度为70％的1mg紫杉烯，而化学合成需要经过25步反应才能完成”。。无论天然提取还是 合成都很难获得用于紫杉醇生物合成研究的足量紫杉烯。 …tE …te 2x‘t-co^W■■+3-■●#■■ l p…★● 日MG-c¨-■■-5-■■ }■■(DxP) l } L、、。，鲁i矗§ID。，， lGPPt■ ||FPPt● *★㈣P★● ● …譬蟊。。。 ☆● 图lA紫杉烯合酶催化形成紫杉烷母核结构。 图1B在大肠杆菌中建立一个“新”的 合成紫杉烯的代谢途径。★表示需要进 行高表达的催化反应步骤。