猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测的建立.pdfVIP

猪巨细胞病毒Taqblan荧光定量PCR检测的建立 王东方，拜廷阳2，吴志明1，闫若潜1，赵明军1，李文山3，赵雪丽1，王淑娟1，刘梅1 疫病预防控制中心，河南鹤壁，458030) 病毒(Porcine real-time PCR，FQ—PCR)，进行了FQ—PCR 了猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法(fluorescentquantitative 检测方法的敏感性、特异性和重复性试验；对疑似PCMv感染临床样品进行了应用检测。并与常规PCR方法进行了比 准曲线的循环闽值(ct值)与模板浓度有良好的线性关系，相关系数为0．998；检测灵敏度可达1拷贝／虬，是常规PCR 的100倍；特异性高，对pGEM—T／PC删重组质粒扩增呈现阳性反应曲线，而对6个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反 进行应用检测表明，其中有9份样品为阳性，与常规PCR方法检测的阳性符合率为100％。猪的内脏器管中PCMV含量 最高为扁桃体，最低的为小肠。成功建立了PCMVF0一PCR方法，可用于临床上PCw感染猪的确诊和隐性感染猪的早期 检测，对PCMV的快速诊断、综合防控及净化等具有重要意义。 关键词：猪巨细胞病毒；实时荧光定量PCR；TaqMan荧光探针；检测；应用 属B疱疹病毒亚科，致猪发病的为猪巨细胞病毒(Porcine 染病。该病毒首次从英格兰分离，是继伪狂犬病毒之后发现的第2个猪疱疹病毒【1】。患猪特征性临诊 症状为食欲废绝，母猪繁殖障碍，表现为流产、死产、木乃伊胎、产弱仔等；仔猪有明显的眼炎、鼻 炎和肺炎症状，生长发育不良，增重差。本病毒分布广泛，大多数常规条件下饲养的猪群均存在PCMV 感染，而且抗体阳性率都很高，但一般为亚临床型。自从1955年Done首次报道该病以来，在英国、日 本、德国、美国和澳大利亚等地区猪群的血清抗体阳性率大于90％。在感染猪群中，血清抗体阳性率 高达98％：近年来，猪群中PCMV感染呈现上升趋势，且多与猪蓝耳病等混合感染，大大加剧患猪的 病毒，对异种移植构成的潜在威胁也引起了相应重视[4，5，6]。 建立PCMV的快速诊断对该病的早期诊断、防治及公共卫生等具有重要的意义。传统的病毒分离 方法需进行体外细胞培养增殖并观察细胞病变，但由于PCMV在体外增殖较困难，所需时间长，费时 费力，难以推广应用。因此建立猪巨细胞病毒快速、敏感、定量、特异的诊断方法非常必要。迄今为 至，尚无利用FQ—PCR检泱JPCMV感染的相关报道。特对建立PCMvTaqManFQ．PCR检测进行试验， 现将结果报告如下。 1材料与方法 1．1主要试剂及仪器 Fisher公司产品；ABI7000荧光定量PCR仪为美国应 KingFisher全自动核酸提取仪为美国Thermo 等均购自大连(宝)生物工程有限公司；磁珠法核酸全自动提取试剂盒购自Ambion生物科技公司； pGEM．TEasy载体购自Promega公司： 1．2质粒、菌毒株及检测样品 由河南省动物疫病防控制中心实验室提供。ST传代细胞源猪瘟(csFv)活疫苗毒株为广东永顺生物 制药有限公司产品。检测样品采自河南省部分猪场，诊断为临床疑似PCMV感染后采集的15份病死猪 489 的提取。 1．3 引物与TaqMan探针的设计与合成 3．0软件设计1对特异引物对P1／P2 根据GenBank中DNA聚合酶基因保守序列，利用PrimerExpress (P1：5-TGGCACTGATACTTGACA CCGTGAAGC AAA AGC一3’／P2(5乙CTC CGT A一3’)和 CTTGCCCTCAAGGTGACG TaqMan探针(FAM．5’一CAG 生物工程有限公司合成。 1．4引物和探针浓度的筛选 用矩阵法对FQ．PCR的循环参数、引物和探针浓度以及所选引物与探针的组合等进行筛选优化， 以得到最佳的荧光定量P