猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立.pdfVIP

囝 201 298 o年学术年会 李文涛¨，李文洁，刘淑清，汪洋，杨昆，邹浩勇，何启盖¨· (华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室，武／x．430070) 麓要；本研究旨在建立—种针对猪圃环病毒2型特异、敏感的定量PCR方法．根据Ge刖Bank中猪圃环病毒2型 O盯2基因序列的保守区域设计合成引物和探针，以试P-脏_0盯2阳性重组质拉为标准品模板制作荧光定量PcR标准曲 线．用谊方法对临床采集的54份血清样品进行检测。并与常规PeR方法进行敏感性和特异性比较，结果显示：所建立 阳性的样品。定量PCR均为阳性．上述结果显示该方法适合用于PCY2的流行病学调查和临床诊断． 关键词l猪圃环病毒2型；实时荧光定量PeR；TaqMan探针 猪圆环病毒(Porcine 起病变，其中，PCV2被认为是断乳仔猪多系统衰竭综合征(PostweaningMutisystemicWasting 业造成巨大的经济损失。 目前PCV2常用的检测方法主要有病毒分离与鉴定、间接免疫荧光(IFA)【1】、酶联免疫吸附法 测等方面尚不理想。常规PCR检测技术可对特定基因进行扩增，但不能进行定量分析，对低拷贝数的 靶片段DNA的有效扩增不理想，而且因交叉污染容易出现假阳性。实时荧光定量PCR检测技术是近 年来发展起来的一种新的DNA／RNA定量检测技术，该技术不仅能对DNA模板进行定量，而且具有 很高的灵敏度、特异性和可靠性，能够实现多重反应，无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已 经广泛的应用于分子生物学研究和医学研究等领域。 测方法。对采集血清进行检测，检测效果良好，为PMWS病毒血症和早期快速诊断提供了一种简便、 特异、敏感的方法。 l材料与方法 1．1主要仪器和试剂 ·基金项目：国家公益性行业(农业)科研专项(nyhyzx07-34)；现代生猪产业技术体系专项(nycytx-009) ¨作者简介：李文涛(1986-)．男，硕士研究生．主要从事动物疾病诊断与分子流行病学研究。 liweatao@webmail．hzau．edu．cn ·¨通讯作者：何启盖，Tcl：027一蚴69／4·E-mail：heqigai@yahoo．∞m 第二届中国兽医临床大会优秀论文 囝 299 型电泳仪为北京市六一仪器厂产品；高速冷冻离心机为Eppendorf公司产品。采用的分子生物学试剂 (包括DL2000 片段回收试剂盒购自杭州博日科技有限公司。 1．2细菌工程菌株、质粒、阳性血清 PCVl、CSFv、PPV阳性病料由本实验室保存。 1．3病毒DNA和RNA的提取 DNA 采用Viral 1．4重组质粒的提取及浓度的测定 根据OMEGA质粒提取试剂盒的操作方法提取质粒，将质粒提取物用去离子水稀释后，测定波长 为260 nm与280 定量PCR的标准品)，并计算重组质粒浓度。 1．5实时荧光定量PCR检测方法的建立 探针和引物的设计参照文献报道【6】，探针和引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。探 针和引物序列为： 正向引物Pl： (TAMRA)-3’。 PCRMaster min， 应，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为50℃2 95℃预变性60S。然后 94℃变性15S，6012退火／延伸60S，进行45个循环。 标准曲线的建立 光定量PCR仪上检测，得出动力学曲线，并建立相应的标准曲线。 灵敏性检验将标准质粒作lO倍梯度稀释，稀释至荧光定量PCR仪最低检出浓度，由此计算出 荧光定量PCR仪所能检出模板的最低拷贝数。 和PRRSV的cDNA进行检测。 PCR检测方法根据文献【5】报道的方法对PCV2进行PCR检测。 1．6临床样本的检测 ViralDNA 54份血清样品均从疑似PMWS病例中获得。样品的DNA根据OMEGAkit说明书所 描述的方法进行抽提。取l止模板分别用于定量PCR的检测和普通PCR的检测。 1．7统计学分析 以上TaqMan定量PCR方法的特异性，敏感性实验，均至少进行三次。 2结果 2．1重组质粒浓度的测定 度要求。根据每个阳性质