药物筛选用乙酰乳酸合成酶比活测定探究.pdfVIP

中国化工学会农药专业委员会第九届年会论文集 药物筛选用乙酰乳酸合成酶比活测定研究冰 曹殿芳周家驹 (中固科学院化工冶金研究所，北京，100080) 摘要本研究建立一个规范化的分光光度法测定乙酰乳酸合成酶的活性．选用硫酸终止酶促反应，同时将 ’ 产物乙酰乳酸转化为3一羟基丁酮，在肌酸存在下与1一碱萘酚形成红色络合物，最大吸收波长．．520nm，摩尔 吸光率2．33X10‘，检出下限浓度5X10q∞，检出量0．2ug．该法已用于高效除草剂离体筛选模型中乙 酰乳酸合成酶活性的测定． 关键词 乙酰乳酸合成酶 比活 药物筛选 乙酰乳酸合成酶(EC4、1．3、18，AcetolactateSynthase，缩写ALS)存在于植株生长 过程中，它能以高度专一性和极高催化效率催化丙酮酸为乙酰乳酸，从而导致侧链氨基酸 ’ 的生物合成。以ALS酶为靶标建立的离体筛选模型能快速寻找可成为高效除草剂的先导化合 物。作为生物催化索JALS酶的比活是判定其质量标准的重要参数，是研究酶促反应速率的依 据，是建立分子水平离体筛选模型的基础。文献报导用气相色谱法测定乙酰乳酸，本文借 鉴血液中3～羟基丁酮的显色原理，通过各种条件试验，建立了一个规范化的测ALS酶活性 的分光光度法。蛋白测定采用Lowry法，从而计算比活。 一、试裁与仪器 1、试剂与配制 硫胺素焦磷酸(TPP)，Sigma公司，5mmol／L水溶液 。黄素腺礤岭双核苷酸(FA口)，Sigma公司，100pmol／L水溶液 3一羟基丁酮，Aldrich公司，40ug／ml水溶液 丙酮酸钠(进口分装)，80mmol／L水溶液 肌酸(进口分装)，0．5％水溶液 ’ 磷酸氢=钾二级，lmol／Lg．溶液 mol／L水溶液 氯化镁二级，50m 硫酸二级，3mol／L水溶液 氢氧化钠二级，2．5mol／L水溶液 NaOH水溶液中) 卜碱萘酚二级，5％(溶于2．5mol／L ALS酶(中国科学院化工冶金研究所生产，专利产品) ” 酶促反应溶液： (A)比HPOI20mmol／L水溶液 1 I (B)砌P0‘40mmol／L，丙酮酸钠40mmol几，mgCl2mmol／L，TPPmmol几和FAD 20umol／L水溶液 2、仪器 Shimadzu PR-1分光光度仪 电子恒温电热水浴锅(范围20一100℃，温波±1℃) 二、结果与讨论 I、ALs酶促反应原理 ALS酶是一羊中裂台酶，其催化反应类型为脱羧和C-C键生成。选择丙酮酸为底物，硫胺 $国家自然科学基金资助项目批准 中国化工学会农药专业委员会第九届年会论文集 ·109· _素焦磷酸，一黄素腺嘿呤双核营酸及镁离子为辅酶，在适宜的磷酸盐缓冲溶掖牛l叶一ALs酶催if,- 丙酮酸为乙酰乳酸，用硫酸停止酶促反应，同时将乙酰乳酸转化为3一羟基丁酮，在含胍基 化合物存在下，与卜碱萘酚形成红色络合物，分光比色测E值。 2、ALs酶促反应条件 E ● 0．5 ●