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马铃薯Y病毒简并引物的开发与检测应用
史凤阳 高芳銮 常 飞 詹家绥
福建农林大学植物病毒研究所，福建福州350002
摘要：本研究根据马铃薯Y病毒不同株系126条CP基因序列的上下游保守区设计了一
对简并引物。同时利用RT-PCR技术，对不同株系的PVY样品进行了检测应用，检测结果表
明，所开发的简并引物特异性强，适用于PVY各株系的检测。
关键词：马铃薯Y病毒；CP基因；简并引物；株系
First—StrandcDNA DNA
Synthesis
SuperMix、TransTaqTMPolymeraseHiFi为北京全式金
(TransGen)公司产品。
1．2毒源
virus
℃超低温冰箱。PvY不同株系的阳性样品及马铃薯x病毒(PotatoX，PVX)、马铃薯M
virus virus vi—
病毒(PotatoM，PVM)、马铃薯A病毒(PotatoA，PVA)、马铃薯S病毒(Potato
ruS leaf—roll
S，PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato
入境检验检疫局检验检疫技术中心提供。
1．3 RNA提取
PlantRNA
使用EasyPure Kit提取P、吖总RNA，将马铃薯叶片和BB6于研钵充分研磨，
000 000
转入离心管中12 r／min，3
min，取上清；加入O．5倍体积混匀，加入离心柱中，12
000 000
r／min，30S，弃液体；加500CB6，12r／rain，30
IxL S，弃液体；加500止LWB，12
000 l孙lase—free
r／min，30S，弃液体；12 r／min，2min，静置数分钟；加100IIL H20在离
000
心柱中央，静置lmin；12r／min，2min，储存于一80℃备用。
1．4引物设计
DnaSP软件选择保守区。采用Primer
5软件设计简并引物，并经过Oligo对所设计引物的质量
7一
进行评估。最后确定用于扩增CP基因的简并引物CP—WCP—R的碱基序列分别为5
小为803
bp，引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。
1．5 RT—PCR扩增
First—StrandcDNA
取2斗L总RNA用oligo(dT)18为引物按照TransScfiptSynthesis
SuperMix操作说明书进行反转录获得P、w全长eDNA。
HiFiBufferII nMdNTPs
PCR扩增采用50曲反应体系为：10×TransTaqTM5曲，2．5
4止，正向引物(10t工mol／L)2止，反向引物(10Braol／L)2灿，ddH：O34．75灿，
HiFi 2
TransTaqTMPolymerase(5U／此)O．25ILL，cDNAIxL。
PCR扩增程序条件为：94℃预变性5min，94oC变性30S，55oC复
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