紫云英非特异性转脂蛋白AsIB259的体外酶活性及在共生固氮中的功能.pdfVIP

第33卷 第 3期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vo1．33 No．3 2014年 5月 JournalofHuazhongAgriculturalUniversity M ay2014，19~25 紫云英非特异性转脂蛋 白AslB259的体外酶活性 及在共生固氮 中的功能 李一星 王建云 石晓峰 陈大松 李友国 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070 摘要 将紫云英AslB259基因编码的一个预测的非特异性转脂蛋 白AsIB259(nsLTP，non-specificlipid transferprotein)在大肠杆菌表达菌株Rosetta2(DE3)中进行了诱导表达，体外测定AslB259蛋白的脂质结合动 力学特征，检测它对不同碳链长度脂肪酸及其衍生物的结合能力，进一步考查AsIB259超表达对紫云英毛根结 瘤情况的影响。结果表明：AslB259具有转脂蛋白的典型特征，与16~22碳链长度脂肪酸的结合活性较强，对 茉莉酸也表现出一定的结合活性；AsIB259超表达导致根瘤数量增加 1．5倍且固氮酶活性降低，说明该基因在 根瘤形成和固氮过程中发挥重要作用。 关键词 非特异性转脂蛋白；AsIB259；体外表达；脂质结合活性；共生固氮 中图分类号 S154．38 1 文献标识码 A 文章编号 1000—2421(2014)03—0019—07 植物非特异性脂质转移蛋 白(non-specificlipid 们的氨基 酸序列 同源性 只有 19 LI。其 中 transferprotein，nsLTP)是广泛分布于多种植物中 AslB259编码蛋 白预测大小为 14．8ku，AslB259 的一类小分子分泌蛋白，在体外可与多种脂质结合。 在根瘤中特异表达，其转录水平呈现先升高后降低 它们含有高度保守的结构特征：由8个位点高度保 的趋势，在接种根瘤菌 22d左右表达量达到最高， 守的半胱氨酸残基形成4对二硫键和2个一致的五 在接菌40d之后表达水平明显下降I1。这从一个 肽模体[】]。目前 已从 多种植物 中分离到 1O类 侧面说明了它可能与根瘤发育和固氮功能有关。本 nsLTP，其 中在开花植物 中常见 的为 LTP1和 研究将AslB259编码蛋 白在大肠杆菌中诱导表达， LTP2两个家族[2]。两者二级结构基本相同，但在 测定了其脂质结合活性及与不同底物的结合能力， 分子质量、等电点和脂质转运活性等方面存在差异， 并检测了该基因超表达对紫云英毛根结瘤表型及 固 且序列同源性低于 3O [引。最初认为LTP的作用 氮活性的影响，以期获得直接证据确证该蛋 白的生 是参与脂类的转运[4]，但后来的研究发现，它们在植 化性质及其在共生固氮过程中的功能表型。 物中以家族形式存在，在植物生长发育过程中发挥 1 材料与方法 了多种功能，如参与植物蜡质的合成和运输Is]、参与 角质层的形成[、增加细胞壁的延展性[7]、参与植物 1．1 材 料 对生物及非生物胁迫 的抗性l8]、与花粉成熟有 大肠杆菌 (Escherichiacoli)表达菌株 Rosetta 关[]、和钙调素结合起调控作用l11]等；最近还发现 2(DE3)购 自Novagen公司，该菌株可 以识别稀有 LTP在根瘤菌与植物共生过程中发挥作用L1。 密码子；发根农杆菌 K599(Agrobacteriumrhizo— 豆科植物紫云英可与根瘤菌共生固氮，在紫云 genesK599)由华中农业大学生命科学技术学院张 英中存在一套与共生相关的功能基因L1。在前期 忠明教授赠送；华癸中慢生根瘤菌 (Mesorhizobium 工作中，我们利用抑制差减杂交从紫云英中分离得 huakuii)7653R、表达质粒 pET28a(+)和植物表达 到 2个转脂蛋 白基因AsE246和AslB259。分子质 双元载体pBI121均为华中农业大学微生物学国家 量和等电点预测结果表明，二者均属于 LTP1，但它 重点实验 室生物 固氮研 究室保存；克 隆载体 收稿 日期：2013一lO一12 基金项 目