电动冻结破碎法提取组织蛋白和RNA的实验观察.pdfVIP

临床与实验病理学杂志 JClinExpPathol 2014May；30(5) ·577 · 组织 (匀浆30S一1min)，0．1g和0．3g组织进行 自动冷冻 结果显示高盐裂解液提取蛋白LaminB和 31-actin蛋白含量 粉碎 (6500r／rain，1min)。匀质后加入等体积的氯仿，混匀 有所下降。 后4℃ 13000r／min离心5min，抽取水相后加入等体积异 丙醇 ，混匀后 4oC 13000r／min离心 20min，75％乙醇洗涤 后干燥，DEPC水稀释后紫外分光法定量。 1．4 SDS电泳和Westernblot法检测 平衡各上样 孔中的蛋白量 ，按每孔90 g上样配置 10％分离胶和5％浓 缩胶 ，浓缩胶段采用 100V电压电泳 15rain，分离胶段采用 110V电泳 110min或待溴酚蓝跑至分离胶底部上 1am时 终止电泳。将浓缩胶切去。考马斯亮蓝 R-250检测蛋白分 离情况，用考马斯亮蓝 R-250染色凝胶 30min，脱色液脱色 FB H H+S 30min，照相。 取电泳后获得的SDS—PAGE凝胶按半干转印法进行转 膜。根据 Marker指示 ，由于B．actin的相对分子质量为4．3 ×10，LaminB为6．7×10，截取相对分子质量 (3．5～8．0) ×10范围内的 SDS．PAGE胶，然后采用 150mA 电流转膜 60min。转膜前要先用膜转移缓冲液浸泡 NC膜以及平衡胶 A —II—g一厘窖 B —II—g一垦蓝 各5min。然后用含5％脱脂奶粉的封闭液室温下封闭1h，4 O 9 8 7 6 5 4 3 2 1 O 5 4 3 2 1 O ℃过夜孵育LaminB或B—actin一抗，室温下二抗孵育2h，用 TBST洗膜后通过 ECL法进行显色，在暗室中压片、显影、定 FB H 影 。 1．5 变性琼脂糖凝胶 电泳 称取 1．0g琼脂糖，加 36ml 图2不同方法提取蛋 白和 RNA所需时间比较 DEPC处理的灭菌水 ，微波炉中融化后 ，冷却至60℃，加入 5 FB．冷冻粉碎；H．均质器；H+S．均质器 +超声；A．蛋白提取 ；B RNA提取 Hll10×MOPS和9ml37％甲醛 (初浓度 12．3mol／L，终浓度 为2．2mol／L)，铺制凝胶。10×MOPS缓冲液 1 l，甲醛 1．8 A l，甲酰胺 5 l，RNA样品2lag，1mg／ml溴乙锭0．5al1，加 18 DEPC水至l0 l，72℃变性5rain后于冰上迅速冷却。在 3 墨 ～ 5V／cm条件下电泳2～3h。电泳结束后(溴酚蓝迁移出8 cm)紫外灯下照相。 蔷 啪 1．6 统计学分析 采用 SPSS13．0软件进行统计分析 ，计 啬l FB H H +S 量资料用 ±s表示，利用方差分析组间差异。 FB1 FB2 C