糖尿病足溃疡创面血管化程度和促血管化生长因子表达变化及其机制探讨.pdfVIP

用ELISA技术对内皮细胞释放VEGF蛋白质水平进行检测。结果：糖尿病溃疡创面局部释放VEGF 水平显著高于正常组，局部释放FGF-2水平与正常组有显著差异，而创面组织中微血管密度显著低 于正常组．高糖环境下，体外培养的内皮细胞释放VEGF水平较正常环境显著下降．结论：糖尿病 患者溃疡创面局部组织血管化受到抑制，促血管化生长因子表达下降或者不升，表n：jg,J面难愈与血 管化受到抑制以及调控血管生长的因子低表达密切相关。 糖尿病溃疡是长期糖尿病患者主要的并发症之一，不仅给患者身心带来痛苦，而且治疗上也非 常棘手．糖尿病溃疡难愈发生机制研究正成为研究重点。其中针对糖尿病溃疡刨面中血管化和调控 血管生长的细胞因子研究的报导不多．高糖环境对溃疡创面愈合过程，特别是内皮细胞功能及其血 管化过程影响的了解甚少。本研究旨在通过对糖尿病患者溃疡和非糖尿病患者创面中血管化程度和 促血管化生长因子表达的差异性分析．研究糖尿病患者创面愈合过程中血管化和相关促血管生长因 子的变化规律，为进一步深入探讨糖尿病合并创面难愈的机制打下基础。 一、材料和方法 1．选择需手术治疗的糖尿病足部溃疡患者12例作为实验组，按世界卫生组织1998年标准确诊符合 耱尿病Ⅱ型诊断。同时选择需手术治疗的足部烧伤患者(无合并糖尿病)12例作对照组。两组患者 均不伴其他严重并发症。 2．取材：糖尿病足部溃疡刨面取材，溃疡包含创缘切取1Xlcm大小组织块两块．一块置于4％中性 福尔马林，另一块作组织块培养待测；对照组切取足部烧伤创面包含创缘1XIcm大小组织块两块， 同样一块置于4％中性福尔马林，另一块作组织块培养待测。 3．组织培养：所获创面组织标本参照Garner等的方法，以lcmxIcm的消毒不锈钢片为模板。剪取 同样大小的组织块标本。经Earles’s液充分洗涤，除去血块和皮下脂肪组织，迅速置于含MCDBll0 液中。终止培养，吸取培养液，高速离心，5009×5分钟，取上清分装，置．70C保存待测。 4．FGF．2蛋白质水平测定： 行。 5．VEGF蛋白质水平测定： 规定的步骤进行． 6．Real-time 为引物，进行相对荧光实时PCR。 7．Real-time 设计引物．进行相对荧光实时PCR。 vessel 8．创面组织微血管密度(microdensity,MVD)评估： 一302～ 所获得组织块标本固定于10％缓冲福尔马林溶液．石蜡包埋，切片，保存。按步骤以抗CD3l 单克隆抗体对皮肤组织标本进行免疫组化染色．采用CCD将光学显微镜观察的图像输入计算机中． 应用图像分析软件对阳性染色区域占视野面积的百分比进行计算，取平均值作统计学处理。 9．细胞培养： 条件下培养，至细胞融合．通过配置不同浓度的葡萄糖或甘露醇将实验细胞分组：(1)正常培液组， 的上清液，高速离心，5009x5分钟，取上清液分装，置-70C保存待测．． 10．统计学处理： 应用SAS统计处理软件对各实验组的VEGF和FGF-2水平的显著性差异比较进行团体t检验， 对MVD结果进行方差分析(ANOVA)． 二、结果 1．FGF-2、VEGF蛋白水平表达(见表1)： 溃疡创面VEGF蛋白水平为108-+4．6pg／inl，两组比较有显著差异fvO．01)． 表l糖尿病溃疡创面和非糖尿病刨面表达FGF-2和Ⅵ’GF蛋白水平比较 ·与烧伤剖面比较，经t检验，po．05△与烧伤创面比较，经t检验，po．Ol 2．FGF-2和VEGFmRNA表达(见表2)： 面为8．4士1．2x104拷贝数，两组比较有显著差异(p《0．01)。 表2不同创面FGF-2和VEGFmRNA表达(x104拷贝数，i蛔) +与烧伤剖面比较，经t检验。V0．们△与烧伤创面比较．经t检验，p四．0l ～303～ 3．不同创面组织血管内皮细胞CD31免疫组织化学染色和MDV计数结果 应用免疫组化方法以抗CD31单克隆抗体选择性显示血管内皮细胞，此方法成熟可靠．除内皮 细胞外，其他细胞组织均未染色．使内皮细胞清楚显示．经图像分析．烧伤创面组织的微血管密度 (MVD)较糖尿病溃疡创面MVD有明显增多，具有统计学意义，po．05。(见表3) 表3糖尿病溃疡创面和非糖尿病创面微血管密度比较 分组