注射的表达hBMP7的髓核细胞延缓同种异体椎间盘移植后的退变的实验与研究.pdfVIP

2012第九届北京骨科年会 hTERT基因转染对犬髓核细胞生物学活性的影响 辛洪奎张超王德利吴剑宏王超峰何勃阮狄克 海军总医院骨科暨全军腰椎间盘病诊治中心(100048) 目的观察rAAV2一hTERT病毒载体转染对犬髓核细胞生物学活性的影响。 mRNA PCR、Elisa法分别检测髓核细胞蛋白多糖、I和Ⅱ胶原mRNA及蛋白 及蛋白的表达；利用real—time 表达量。以上检测均与以rAAV2一EGFP转染的髓核细胞(对照组)进行对比。 蛋白水平检测到hTERT基因在髓核细胞内的表达，而在所有观察时间点内，对照组未能检测到hTERT I 胞的mRNA表达，实验组与对照组在COLmRNA表达上无明显差别；ELISA检测蛋白多糖及Ⅱ型 胶原表达量提示：在转染后10d，实验组PG、COL11的表达量显著增加，在转染后的10—60d，实验 组髓核细胞PG、COLⅡ的表达量均明显高于对照组。 结论使用rAAV2-hTERT病毒转染可成功实现体外培养条件下髓核细胞增殖能力及细胞外基 质表达的上调，这将有可能为椎间盘退行性疾病的生物治疗提供更为理想的种子细胞选择。 关键词 髓核细胞hTERT基因转染 注射表达hBMP7的髓核细胞延缓同种异体椎间盘移植后的 退变的实验研究 王超锋张超王德利吴建宏何勃阮狄克 海军总医院骨科 目的在同种异体椎间盘移植的基础上，探讨用基因修饰的二蹙髓核细胞与同种异体椎间盘复合 的方法阻止或延缓同种异体椎间盘移植后出现的退变性问题的能力。 方法将18个犬椎间盘置于冻存液中于一196。C冷冻保存2m，随机分为A、B、c三组，A组以 X r．g。AV2一hBMP7转染犬髓核细胞，将能够表达hBMP7蛋白的1105髓核细胞于20ulDMEM／F12培养 基中注射人复温后椎间盘中，体外培养至7天，B组以相同数量未转染髓核细胞注入椎间盘后体外 培养，C组以20ul生理盐水注射后体外培养。将培养7天的A、B和C三组椎间盘分别移植至18只 椎间盘高度随时间的变化情况；而在术后的1m、3m和6m通过检测移植间盘髓核组织的MRIT2像 来分析椎间盘的退变情况；将动物饲养至术后6m时处死取材，对新鲜的腰椎进行生物力学检测， 通过MTS分析腰椎屈伸、侧弯及扭转的变化；并通过HE及胶原染色观察移植椎间盘的形态学改变； 对于A和B组椎间盘中注射的髓核细胞再注射前以PKH一26膜染料进行荧光标记，将取材后的部分 椎间盘组织进行冰冻切片，通过PKH一26的红色荧光观测注射的外源性髓核细胞的存活情况；取材 后通过PCR法检测三组髓核组织中hBMP7 mRNA的表达。 ·496· 书面交流 结果DR片检测结果显示除C组有1例犬的移植椎间盘出现了跨椎问盘的骨性融合外，其余 17例移植椎间盘均与上下椎体愈合，且未见明显的骨刺形成，对植入椎间盘的高度的动态监测显示 三组椎间盘高度改变未见差别(P0．05)；MRI检测结果显示：术后1m三组MRIT2像灰度比未见差 别，而在3m和6m时，移植椎间盘MRI 而对屈伸及侧弯活动度检测发现三组间未见统计学差别；PKH一26荧光检测显示在A和B组复合髓 核细胞的同种异体椎间盘在移植后的6m时，仍可在荧光显微镜下观察到红色荧光的散在表达，证 明移植后6m时仍有外源性髓核细胞存活；对三组椎间盘的HE形态学检测结果发现三组移植间盘结 构均有退变性改变，而A组及B组退变性改变明显较C组轻；髓核的胶原染色显示A组髓核组织胶 原含量较B组及C组明显增多，B组较C组胶原纤维轻度增多；PCR检测结果显示：6m时A组仍 可检测到hBMPmRNA的高表达。 结论通过将hBMP7基因修饰的髓核细胞同同种异体椎间盘复合后在行异体移植的方法能明显 延缓单纯的同种异体椎间盘移植后的退变性问题。但需要大规模的动物实