小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达.pdfVIP

维普资讯 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysi10 Qo7 i垒2； 二 【文章编号】 1000-4718{2007)06—1204—40 小鼠pdx一1基因真核表达载体的构建及其 在胚胎干细胞 中的表达 水 周光纪 ， 徐海伟 ， 杨 丽 ， 唐 军 ， 李达兵 ， 屈纪富 (。广东医学院基础部生理学教研室，广东湛江524023；第三军医大学 生理学教研室， 附属西南医院急诊科，重庆4ooo38) 【摘 要】 目的：克隆小鼠p 一1基因，构建其真核表达载体 ，并在小鼠胚胎干细胞中表达 ，为糖尿病的细胞 移植治疗奠定基础。方法：PCR扩增小鼠胰腺础 一1基因eDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表 达载体pEGFP—NI重组，将p 一1基因 eDNA片段连接到pEGFP—N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP／ p 一1，转化大肠杆菌DH5~~菌株，构建成p 一1基因真核表达载体质粒。扩增 DH5~~后抽提质粒DNA， rIdⅢ 和BamHI酶切，电泳 ，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒 DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞 MESPU13。结 果：从小鼠胰腺eDNA扩增出876bp的DNA片段并成功重组到pEGFP—N1载体中。经酶切和DNA测序验证 ，插 入载体的DNA片段为pax一1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24h后观察到 绿色荧光蛋白报告基因和 目的基因的pdx一1表达。结论：小鼠础 一1基因的克隆和真核表达载体构建获得成 功，为进一步研究其功能奠定了基础 。 [关键词] 基因，pax一1；胚胎干细胞；真核表达载体 [中图分类号] 11318．15 [文献标识码] A Constructionofmol／sepdx ·-·1geneeukaryoticexpressionvectorand its expression inembryonicstem cells ZHOUGuang—ji，XUHai—wel～，YANGLi，TANGJun，LIDa—bing，QUJi—fu (DepartmentofPhysiology，GnangdongMedicalCollege，z ， 524023，China；DepartmentofPhysoiolyg，Emer- gencyDepartment，SouthwestHospital， MilitaryMedcialUniverstiy，Chongqing400038，China) [ABSTRACT] AIM ：Toclonemouse础 一lgeneandconstructitseukaryotieexpressionvectorforexpressionof pI如 一linmouseembryonicstem cells．M ETHODS：Mousep 一lcDNA fragmentWaSamplifiedwit}lpolymerasechain reaction(PCR)frommousepancreaticeDNA．Thepurifiedfragmentwasrecomb inatedwithaeukaryoticexpressionvector carryingenhnacedgreenfluorescentprotein，pEGFP—N1．Th ep 一leDNA fragmentwasinsertedintothemulti—clone sitesofhtevectortoconstructanew plasmid．pEOFP／pdx—1．E coUistrainDl-15otwastransfectedwiht thenew