阴虚动风证帕金森病LD大鼠GDNF变化的动态研究.pdfVIP

全国第十一次中医诊断学术年会论文集 DAB显色试剂盒：均为迈新生物技术有限公司产品。 1．1．4仪器 1)：上 大鼠脑立体定位仪：TOW-3A型，广东汕头市教育医学仪器厂；微量迸样器(5II 海第三分析仪器厂；旋涡混合器：XT／-80A，上海医科大学仪器厂；分析天平：Sartorius 包埋机；湿盒：迈新生物技术有限公司产品；秒表；上海秒表厂，926266。 1．2模型制备方法 1．2．1 PD模型制备 采用经典、公认的Ungerstedt懵1等所仓Ⅱ立的方法。术前按常规进行行为测试，确认无异 常旋转行为后，用戊巴比妥钠(3％的戊巴比妥钠，50mg／kg)腹腔注射麻醉。然后将大鼠固定 于脑立体定位仪上，头部去毛，苯扎溴铵(商品名：新洁尔灭)常规消毒。无菌条件下，沿正 中线切开大鼠颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前囟。以前囟为准，根据包新民埔。等著大鼠脑立体 定位图谱，确定右侧黑质二坐标：①前囟后5．2mm，正中线右侧1．0mm，硬膜下9．0mm。②前 囟后5．2mm，正中线右侧2．5mm，硬膜下8．5mm。用颅骨钻于手术要求部位小心钻开颅骨，用5 ul微量进样器将6-OHDA(溶于含0．02％维生素C的生理盐水中，即秤量药品抗坏血酸0．0019， 溶于生理盐水5ml中)注入右侧黑质部(以1．Omm／min速度缓慢进针)，每孔3|l1，注射速度为 lul／min，注射完毕后留针5min，然后以1．Omm／min速度缓慢退针。手术完成后，用医用 明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口皮肤，肌肉注射庆大霉素7天，待动物清醒后放回饲养笼中 饲养。 lOd后，以腹腔注射APO 0．5mg／kg诱发大鼠向一侧旋转，记录开始旋转至30rain内的旋 转圈数，以旋转圈数平均7次／min者为合格的PD模型Ⅲ。 1．2．2阴虚动风证帕金森病LD大鼠模型制备 将成功的PD模型大鼠给予腹腔注射左旋多巴／苄丝肼(50mg／kg左旋多巴和12．5mg／kg 苄丝肼即左旋多巴和苄丝肼溶于含0．05％的乙醇和0，l％的抗坏血酸的注射用水中，配成 lOmg／m1)，每目两次(分别为上午9时和下午5时)，连续2周。2周后诱发动物，具有典型AIM 表现，且APO诱导大鼠对侧旋转圈数增加者，为成功阴虚动风证帕金森病LD模型(简称阴虚 动风证LD模型)“11。 假手术组只注射含0．02％维生素c的等量生理盐水，其余条件与造模手术相同；正常对 照组只固定大鼠，不进行任何处理，亦均为lOd。正常对照组、假手术组、PD模型对照组给 予腹腔注射等量的含0．05％的乙醇和0．1％的抗坏血酸的注射用水，每日两次，连续2周。 1．3分组及给药 本研究共分4组，正常对照组、假手术组、PD模型对照组、阴虚动风证LD模型组，每组 18只。其中阴虚动风证LD模型组大鼠腹腔注射左旋多巴／苄丝肼(50mg／kg左旋多巴和 12．5mg／kg苄丝肼，PD模型对照组、正常对照组、假手术组给予腹腔注射等量的含0．05％的 乙醇和0，l％的抗坏血酸的注射用水。每组在2周、4周、6周三个不同时间点，各取6只大鼠， 进行GDNF的免疫组化检测。 1．4GDNF免疫组化检测方法 (1)石蜡切片常规脱蜡和水化；(2)PBS(PH7．4)冲洗3次，每次5分钟； (3)采用柠檬酸抗原修复液煮沸对组织进行抗原修复；(4)PBS(PH7．4)冲洗3次，每次 (PH7．4)冲洗3次，每次5分钟；(7)每张切片滴加一滴增强液A液，37℃反应20分钟， 新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察显色卜2分钟；(10)自来水冲洗终止反应，苏木素复 361 全国第十一次中医诊断学术年会论文集 染，自来水冲洗返蓝，盐酸酒精分化；(11)梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封固； (12)阴性对照一抗用PBS代替，其余步骤按以上操作；(13)镜下观察。在2周、4周、6 周三个不同时间点，每组观察6张切片，每张切片在光镜高倍镜下随机取3个4mm2视野， 计算阳性反应细胞。分析软件使用IMS彩色图像分析系统软件。 1．5统计学处理方法 所有资料均用均数±标准差(X±S)表示，采用SPSS13．0版软件进行齐性检验和方差 分析。 2结果 2．1阴虚动风证LD大鼠纹状体GDNF的动态变化 各