慢传输型便秘大鼠结肠肌间神经丛氮能神经及其胆碱能神经反应性改变.pdfVIP

中华医学会 嚣届lJ删薯豫研-寸兮 晕囊鬈慧嗣奠—露曩聋—■翻墨一 慢传输型便秘大鼠 结肠肌间神经丛氮能神经及胆碱能神经反应性改变 何傻堂刘海峰房殿春龙庆林王国安 第三军医大学附属西南医院全军消化专科中心(重庆400038) 便秘是临床上一种常见症状，主要表现为大便次数减少，无便意．排便困难，排便不尽感等。近年的 研究表明结肠运动是在肠内神经系统、自主神经系统、中枢神经系统三者共同调节下完成的。其中肠神经系 nervous 统(enteric system．ENS)功能紊乱与慢传输型便秘关系密切。我们利用复方苯乙哌啶建立大鼠慢传输 型便秘模型，同时利用铺片技术制作结肠肌问神经丛标本，采用酶组织化学技术在铺片上显示便秘大鼠结肠 肌间神经丛内AchE神经及NOS神经的分布、形态学特征及递质含量变化，从神经病理学角度探讨慢性传输 型便秘的发病机制。 材料与方法 一、材料 成年健康Wistar大鼠32只．体重在100—1209之间，雌雄各半，由本校动物所提供。按照随机化原则分 为对照组、复方苯乙哌啶组。分组后各组问体重、鼠龄无显著差别。所有大鼠均分笼饲养．保持适宜的环境 (室温16C一25。C；相对湿度50％一70％．清洁安静，相同的光照条件)。给药剂量根据每只动物的体重、饲 料消耗量计算。对照组饲料由本校动物所配制．复方苯乙哌啶为河南省常乐制药厂制造。 二．方法 1．动物饲养：对照组饲以普通饲料．复方苯乙哌啶组饲料中添加有复方苯乙哌啶，剂量为8mg／kg体重。 20天。 每5日记录一次大鼠大便粒．大便干重及体重。饲养时问为1 2．结肠组织组化染色分析：大鼠禁食12h．3％戊巴比妥钠麻醉后，通过腹部正中切口暴露腹腔，切取整 段结肠。结肠取材后用001mol／L磷酸缓冲液(PBS)(pH74)冲洗。以4％的多聚甲醛充盈到合适程度后将结 01mol／L 结肠取出，用0 PBS漂洗三次，再将肠管剪成长约1cm的小段，将一粗细合适的玻璃棒插入肠管． 然后用镊子在肠系膜附着处沿肠管纵轴划痕，用一镊尖沿划痕轻轻剥离纵肌层．制作肌间神经丛铺片标本， 将铺片标本收集在007mol／L 2 58m1． 5mg，0B2％醋酸钠1 间神经丛铺片标本用PBS冲洗3次．移入新鲜的孵育液中(腆化乙酰硫代胆碱1 0 1 2m1) 5m1．0 5m1．蒸馏水2 6％醋酸05ml，294％柠檬酸钠15ml，075％硫酸铜2 65％铁氰化钾2 37。C下孵育60分钟。对照实验：孵育液中不加碘化乙酰硫代胆碱。还原型尼克酰胺腺嘌吟二核苷酸脱氢酶 (NADPHd)组化法显示氮能神经，将制备好的结肠纵肌层标本用PBS冲洗3次，移八新鲜的孵育液中(B— NADPH 1M Iml，0 TrisHCI(pH7 10mg．NBT 1m1．DMSO 2mg．10％TritonX一100 钟。取出标本．PBS冲洗3遍，铺于玻片上．晾干后逐级酒精脱水、二甲苯透明．中性树胶封片．光镜观察、 照像。对照实验：孵育液中不加碘日一NADPH。 3．结果分析：在100倍显微镜下对神经节内氮能及胆碱能阳性细胞计数．每组取8例标本，每例随机选 取5个神经节．共40个神经节进行计数。氮能神经元着色深浅采用目测半定量法．按弱阳性(浅蓝色)．阳性 计C蓝色．深蓝色)．同时随机测定胆碱能神经节内100个神经元的直径及胞核的直径