附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的原核表达及纯化.pdfVIP

第32卷第2期 国 外 医 学 医 学 地 理 分 册 V01．32No．2 2011年 6月 FoREIGN M EDICAL SCIENCE SECT10N 0FM EDGE0GRAPHY Jun．2011 ·83 · 附睾蛋 白酶抑制剂 Eppin蛋 白的原核表达及纯化 张 洁 ，丁新 良 (1．苏州大学医学部公共卫生学院卫生毒理教研室，江苏苏州 215123； 2．无锡市疾病预防控制 中心公共卫生部 ，江 苏无锡 214023) 摘要 ：目的 构建人附睾蛋 白酶抑制剂 Eppin蛋白的重组质粒 pET28a(+)一Eppin，并研究该质粒在原核细胞 中的表 达及纯化 。方法 本研究以人睾丸组织 cDNA为模板获得人 Eppin基 因片段 ，将其插入 pET28a(+)载体 His6一Tag 上游 ，构建重组质粒 pET28a(+)一Eppin，转化大肠杆菌 BL21(DE3)，经 IPTG诱导表达重组人 Eppin蛋 白后 ，运用 SDS—PAGE进行分析和鉴定 。大量表达的重组 Eppin蛋 白经镍柱亲和层析进行纯化 ，并采用 SDS进行纯度分 析 。结果 PCR扩增 出约 381bp的Eppin基 因片段 ，双酶切及 PCR鉴定证实 Eppin基 因成功插入 pET28a(+)中， SDS—PAGE分析显示表达产物为分子量单位约为 17ku的重组蛋 白，与预期结果一致 ；Eppin的表达量在 IPTG诱导 表达4h时最高，约 占菌体总蛋 白的3O ；重组蛋 白主要在沉淀中出现，表明原核表达时重组 Eppin蛋 白以包涵体形式 存在 ；经镍柱纯化后可得纯度高达 95 的重组 Eppin蛋 白。结论 成功构建 了人附睾蛋 白酶抑制剂 Eppin蛋 白重组 质粒 pET28a(+)一Eppin，该质粒在原核系统中获得 了高效融合表达 ，进一步纯化后可得高纯度 的重组蛋 白，为开展免 疫避孕与生殖免疫的研究奠定基础 。 关键词 ：Eppin；避孕疫苗 ；原核表达 ；纯化 中图分类号：R114 文献标志码 ：A 文章编号：1001—8883(20l1)02—0083—05 Expression ofEppin in prokaryoticcellsand itspurification ZHANG Jie，DING Xin—liang (1．DepartmentofHygieneToxicology，SchoolofRadiationM edicineandPublicHealth， Soochow University，Soochow 215123；2．DepartmentofPublicHealth， CenterofDiseasesControlandPreventionofWuxiCity，Wuxi214023，China) ABSTRACT：Objective ToconstructandpurifytherecombinantplasmidpET28a(+)一Eppininprokaryotic cells．Methods AnEppineDNA wasgeneratedbyPCR，usingthehumantestiscDNA astemplate，whichwas thencloned into vector pET28a(+ )upstream of His6一Tag to constructpET28a(+ )一Eppin．The recombinant plasmidwastransformedintoE．coliBL21 (DE3)，therecombinantBL21 (pET28a(+ )一Eppin)wasinducedwith IPTG，andtheexpressedproductsw