针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠外周血清蛋白表达的干预作用.pdfVIP

[2] 护脑组织 。此外，针刺还可改善缺血病灶区域的能量供应及代谢功能，减轻缺 [3] 血再灌注后神经元细胞坏死、凋亡过程，具有良好的抗氧化应激和脑保护作用 。 SELDI-TOF-MS 技术是上个世纪80年代新兴的蛋白质组学研究技术，广泛 用于生物科技、医学研究等领域。该技术的优势是可直接分析原始生物样本 （血、 尿、脑脊液等）、样品用量少、操作简便、高通量、灵敏性和特异度高等。本研 究应用SELDI-TOF-MS技术观察针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠外周血清蛋白表 达谱的变化，进一步探讨针刺在脑缺血再灌注损伤调节机制中的作用。 1 材料和方法 1.1 实验动物 清洁级 SD 大鼠，雄性，10~12 周龄，体重 280～310g，由中国药品生物制 品检定所实验动物中心提供[动物证书: SCXK(京)2005-0004] 。分笼饲养，饲养条 件为室温 25 ℃±3 ，湿度 75 ％，光照：黑暗=12:12h ，自由摄取饲料和水。 1.2 主要试剂和器材设备 弱阳性离子交换剂(WCX)纳米磁珠试剂盒(北京赛尔迪公司) ；NP-20 芯片校 正质谱仪、Biomarker Wizard Version 3.1.0 软件、WCX-2 芯片(Ciphergen 公司) ； 涡旋混合器 MVS-1(北京北德科学器材有限公司) ；长城牌 KWD-808 Ⅱ全能脉冲 电疗仪(常州市武进长城医疗器械有限公司) ；2636-A 、2634-A 线栓(北京沙东生 物技术公司) 。 1.3 CIRI 模型制备和神经功能评分 [4] 参照 Longa 等 的线栓法制备MCAO 模型。插栓 2h 后拔出线栓以实现缺血 再灌注。动物苏醒后对动物进行神经功能评分，判断造模效果。 神经功能评分：按照 Bederson 等[5] 的 5 级分级法：0 级：无功能缺损；1 级： 不能完全伸展左前肢；2 级：左前肢屈曲，向左侧推动时阻力下降；3 级：爬行 时向左侧转圈；4 级：意识水平受抑制，包括 24 h 内死亡。动物评分为0 分和 4 分的剔除实验。 1.4 实验分组与处理 采用随机区组设计将大鼠分为模型、假手术、电针 3 个大组。每大组再按照 再灌注后时间分成 12h、24h 、48h 、72h、96h 和 144 h 6 个亚组；每个亚组有大 鼠7 只；另设正常对照组 7 只。正常对照组不做任何处理；模型组为造模成功后 190 不做进一步处理；假手术组为模拟手术过程至分离颈内、外动脉后缝合皮肤；针 刺组为造模成功后，根据华氏大鼠穴位图谱定位百会穴、足三里穴，针柄接脉冲 治疗仪，刺激为疏密波、频率 2～100Hz、强度2 mA 。每次20 min ，每日 1 次。 1.5 SELDI 血清样品的提取 取血清：各组大鼠按照规定时间点用4%戊巴比妥腹腔注射麻醉，切开胸腔， 心脏取血，室温下静置2h ，离心20min ，分离血清，存放于-80°C冰箱中备用。 分离蛋白：取10μl血清，加入20μl U9缓冲液，将样品冰浴振荡30min ；加入 360μl WCX-2 buffer 液，混匀。取出 WCX-2 芯片，将芯片装入生物芯片处理器， 每孔加入200μl WCX-2 buffer，置于振荡器震荡5min，甩掉缓冲液；重复上述操 作一次，甩掉缓冲液后在芯片处理器每孔中加入100μl处理好的样品，震荡1h； 甩出样品，每孔加入200μl WCX-2 buffer，室温振荡5min，甩去孔中液体，再次 加入WCX-2 buffer 200μl，重复操作一次。每孔加入HEPES(1Mm,PH 4.0)200μl， 立刻甩出，取出芯片，风干后，立刻在每个加样孔上加 SPA饱和溶液 0.5μl，待 全干后，再加入 0.5μl SPA液。 1.6 数据的读取与分析 芯片全干后上机测定。参数设置：激光强度 205 ，检测敏感度 8，优化分子质 量范围为 1000～15000Da，最高分子质量为 50000Da 。 采用 Biomarker Wizard Versio