鱼类pkz(potein kinase containing z-dna binding domain)zα与z-dna的结合.pdfVIP

摘 要 摘 要 真核细胞翻译起始因子2a(elF2a)激酶是在进化中高度保守的丝氨酸／苏氨酸 蛋白激酶，存在于哺乳类不同的组织和细胞中，通过调节elF2a的活性参与机体 内多种应激反应。新近报道的鱼类PKZ(包括鲫鱼CaPKZ，斑马鱼DrPKZ，大西 一种新的eIF2a激酶。PKZ结构独特，C端为elF2a激酶催化区，而在其N端具 有2个Z．DNA结合域(Za)。 Z．DNA是不同于B．DNA的左手螺旋DNA，具有特殊的空间构象和重要的 生物学功能。为了在体外模拟生理状态下的Z．DNA，我们构建了pMD．1ST／d(GC)n (n=6，8，10，13)，并利用甲基化抑制实验和抗Z．DNA抗体检测其构象。结果显 示，这些插入至质粒的d(GC)n片断能够在负超螺旋维持下形成潜在的Z形构象， 且其形成Z．DNA的能力依赖于d(GC)重复序列的数目。表明d(GC)n越长，形成 Z．DNA的效率越高。同时， 我们构建了pMD．18T／d(TA)n、 形构象的能力，结果发现它们均不能与抗Z．DNA抗体结合。 Za的功 鲫鱼PKZ(PKR．1ike)是首次报道的鱼类PKZ。为深入了解鲫鱼PKZ K56A，P57A，P58A和W60A)。这些重组表达载体转化至表达菌BL21(DE3)pLysS 并诱导表达，经Ni-NTA亲和层析获得各种纯化的融合多肽。 化能力。结果显示，纯化的表达多肽Pzalz心在体外能够形成二聚体但没有多聚 化现象。加入2-ME或SDS后，Pzalza2的二聚化则会被抑制，表明二硫键在稳定 PzaIz心二聚体的过程中起着非常重要的作用。同时发现，pMDl8．T／d(GC)6对 PzaIZa2的二聚化没有任何促进作用。与之不同，2个替换型PzalZal、P缁u2蛋白 则没有发现的二聚化现象。 利用琼脂糖凝胶阻滞实验分别分析了不同的体外表达多肽与 II 摘 要 前者。若解除pMDl8．T／d(GC)n的负超螺旋，它们间的阻滞效应便会消失，这表 V韭JpMDl8-T／d(GC)。的Z形构象是为其负超螺旋所维持的。同时，竞争性实验表明 P缎a2以及9个点突变型蛋白却丧失了对pMDl8一T／d(GCh亲和能力。 与此同时，通过琼脂糖凝胶阻滞实验还检测了Pzalza2与重组质粒 pMD一18T／d(TA)n、pMO一1 尤以 pMD．18T／d(non-GC-repeat)n、pMD·18T／d(TA)n的结合都很弱， pMD．18T／d(TA)n表现为最弱。 另外，我们还克隆了草鱼CiPKZ全长cDNA序列及其启动子序列。序列分 I：C诱导后其表达均会 析结果显示，草鱼CiPKZ具有广谱的组织表达特性，Poly 上调。这些结果表明，鱼类PKZ能够为病毒所诱导、并可能参与宿主细胞的免 疫应答过程。 kinase Z．DNA 验；Proteincontainingbindingdomain(PKZ)；硬骨鱼类 Abstract Abstract initiationfactor memberofthe Eukaryotic 2a(elF2a)kinases，ahi曲ly conserved kinases indifferent Ser／Thr distributed mammalian protein family,ale tissuesandcellsand ina of