谷子在干旱逆境中差异表达基因的分离和表达谱分析.pdf

摘要 谷子(Setarta 界上栽培历史最悠久的作物之一．谷子耐旱能力强、水分利用效率高，适于在我国干旱少雨的地 区播种。目前有关谷子抗旱性分子机制和从谷子中发掘抗旱基因的研究几乎是空白．为了发掘谷 子中的抗旱基因，我们首次利用抑制性差减杂交法构建了谷子干旱诱导表达差减文库和干旱抑制 表达差减文库，并采用eDNA microarray技术分析了差减文库的表达谱，筛选获得了很多有意义的 差异表达片段。文章并报道克隆到一个在谷子根中被干旱逆境特异诱导表达的基因12氧代植二烯 酸还原酶(SiOPRl)，并对该基因的表达特性进行了详细的分析． 拟自然干旱逆境，利用抑制性差减杂交法同时构建了干旱诱导表达差减文库(正库)和抑制表达 差减文库(反库)。正库共挑菌2112个，反库共挑菌1372个，并全部送去测序。序列经过去载体 159个UniESTs。 和去接头后，拼接在一起，最后正库共获得414个Contigs和745个Singletons，合计l 含21个大类，占有比例最高的一类是代谢相关基因，其次是转录相关的基因，再次是参与蛋白质 合成与降解、参与细胞命运、细胞信号转导和能量代谢等生物学过程的基因。 cDNA mictoarray技术对差减文库进行了鉴定和表达谱分析。结果表明，受干旱逆境诱导表达的 ESTs在根中共获得93个，在地上部中共获得52个。受干旱逆境抑制表达的ESTs在根和地上部中分 别获得10和27个。在根和地上部中被干旱逆境共同诱导表达的ESTs仅有5个，共同抑制表达的没 有出现。采用Northernblot杂交实验进一步验证了cDNA microarray的结果，在挑选的l价表达模 式不同的ESTs中，Northernblot杂交结果都很好地与eDNA microarray实验的结果相互印证，有力 地说明了eDNA microarray实验结果的可靠性。 谷子幼苗在干旱逆境下的基因表达谱分析表明，在根和地上部中分别由不同类别的基因参与 响应干旱逆境，表现出不同的分子机制。在干旱逆境下谷子中很多基因是被抑制表达的，因此我 们提出负调控在谷子适应干旱逆境反应中起着重要的作用。一个很有趣的结果是，在谷子根系早 期诱导表达的基因多数是参与糖代谢途径(包括糖酵解、三羧酸循环、和糖异生途径)的酶，说 明谷子根系在最早期的适应性反应是基本能量代谢被激活。此外，发现蛋白质降解和修复在谷子 干旱适应性分子机制中也具有很重要的调控作用。 为了分析ABA和茉莉酸甲酯(MeJA)两种植物激素在谷子适应干旱逆境中的作用，我们采 用同样的芯片．分析了ABA和MeJA处理对谷子基因表达的影响。结果显示，被ABA诱导表达的 个。同时在根和地上部中被ABA诱导表达的ESTs仅有2个，抑制表达的仅有6个．在MeJA处理中， 和22个。同时在根和地上部中被MeJA诱导表达的EST只有1个，抑制表达的也是1个．聚类分析 现，重叠基因的数目并不是太多，因此认为在谷子适应干旱逆境的调控途径中，除ABA和MeJA 调控途径之外还包括其它的途径。 从干旱诱导表达EsT中，我们挑选出两个受PEG强烈诱导的EST，发现编码同一个基因的产 物12氧代植二烯酸还原酶。根据这两个EST片段的已知序列，我们利用RACE技术首次从谷子中 的蛋白质在禾谷类作物的不同物种之间保守性很高。不同逆境因子(包括PEG、ABA、NaCI和 MeJA)处理的表达谱分析结果表明，SiOPRl基因只被干旱逆境处理特异地诱导表达，而且诱导 响。不同组织部位的Northern杂交结果显示，SiOPRl基因的表达水平都很低，检测没有杂交信号。 SiOPRl基因在谷子响应干旱逆境中的表达模式预示着该基因在谷子中是受干旱逆境诱导表达的， 而在正常生长状态下的表达水平很低，推测它可能在谷子的抗旱适应性防御反应中起着重要的作 用． 关键词：谷子，干早逆境，诱导表达，抑制表达，eDNA芯片，12氧代植二烯酸还原酶 Ⅱ Abstract Foxtail