抑食海金藻Aureococcus anophagefferens的氮、磷营养生理和分子检测技术的研究.pdfVIP

Thesis for the Degree of Master The Eco-physiological Studies of Nitrogen and Phosphorus on the growth of Aureococcus anophagefferens and the Molecular Detection Methods Supervisor：GUO hao, LIU Yong-jian, LIU Qing Master candidate ：ZHANG Qi COLLEGE OF AQUCULTURE AND LIFE SCIENCE, DALIAN OCEAN UNIVERSITY, DALIAN, LIAONING, P. R. CHINA JUNE 2014 抑食海金藻的氮、磷营养生理与分子检测技术研究 摘要 近年，我国秦皇岛沿岸海域接连发生褐潮，引发褐潮的关键物种为抑食海金藻。本实 验的研究对象为抑食海金藻，由于抑食海金藻体积微小，在光学显微镜下，难以从环境中 识别出来。本实验主要针对氮磷营养盐对抑食海金藻生理生长的研究及海水中抑食海金藻 的检测。目前，人为因素和自然因素导致大量的氮磷营养盐流入海洋环境中，致使海洋沿 岸水体富营养化。水体营养盐过剩使抑食海金藻大量繁殖，由此引发褐潮形成。 在 18℃、22 ℃条件下对抑食海金藻进行纯培养，我们通过固定不同 P 的起始浓度，改 变 N 的加入量来控制不同的 N/P 。经过 22 天的培养，在光学显微镜下记录抑食海金藻的 生长数量，从而得出抑食海金藻的最适生长条件。经研究发现： （1）在营养盐浓度相同的条件下，在一定温度范围内，抑食海金藻的生长速度和最大 比生长率随着温度的升高而加快。 （2 ）在同一温度、同一P 的起始浓度培养条件下，抑食海金藻的生长速度和最大比生 长率随着 N/P 浓度的增加而先升高后降低。 （3 ）在同一温度、同一N/P 的培养条件下，抑食海金藻的生长速度和最大比生长率随 着 P 起始浓度的增加而先升高后降低。 （4 ）N ，P ，温度过高或过低都对抑食海金藻的生长繁殖有限制作用，并且在不同的条 件下，抑食海金藻的生长繁殖都有一个最适生长范围。 通过对秦皇岛沿岸东山浴场、老虎石浴场和养殖区采集 22 个站位水样进行分析，建 立了检测海水中抑食海金藻浓度的方法。本实验利用荧光定量 PCR 和叶绿素 a 的测定方法 检测环境样品中抑食海金藻的浓度。并将计数、荧光定量 PCR 和叶绿素 a 三种方法所反映 抑食海金藻的浓度建立起相关性。其结果发现：计数只适合实验室纯培养，用于检测荧光 定量 PCR 和叶绿素 a 两种方法的准确性；叶绿素 a 的方法只能用于褐潮发生时期检测海水 中抑食海金藻的浓度，不能应用于前期的预防；荧光定量PCR 可用于褐潮发生的任何时期 及其前期的预防。 通过对秦皇岛 22 个站位的水样分析发现，在 2013 年 8 月，东山浴场和老虎石浴场发 生三级褐潮(200,000 cells ml-1) ，在秦皇岛沿岸的养殖区，4 个站位发生三级褐潮，6 个站 位发生二级褐潮(35,000–200,000 cells ml-1) ；所有的 10 月份采集的养殖区站位都发生一级 褐潮(0 to≤35,000 cells ml-1) 。用测叶绿素a 的方法来检测环境样品中抑食海金藻的含量， 其结果与荧光定量 PCR 的检测方法所检测出的结果有所不同，其原因是叶绿素 a 的方法所 测出的结果反映的是海水中所有微藻的生物量，并非单单是一种藻的浓度，只有当褐潮发 生时，海水中抑食海金藻已成为优势种，其他杂藻浓度甚微，所以叶绿素 a 所反映出的细 胞浓度即为单一微藻的细胞浓度。 关键词：氮磷营养盐；褐潮；抑食海金藻；荧光定量 PCR ；叶绿素 I 抑食海金藻的氮、磷营养生理与分子检测技