核糖体基因区锌指酶位点靶向载体的构建及其打靶研究.pdf

摘要 核糖体基因(rDNA)区可能是一个安全有效的基因打靶区域， 我室基于此开发的非病毒人源基因载体系统——核糖体基因区靶向 载体，能携带多种治疗基因在多种细胞系中成功打靶rDNA18S区 +5468位点，且外源基因能长期稳定地表达。进一步提高rDNA区的 打靶效率可以更充分地发挥该区域作为基因治疗靶位点的潜能，尤其 在打靶病人来源的原代细胞方面带来突破。近年来，锌指酶作为提高 基因打靶效率的有力工具被广泛应用，甚至能将打靶效率提高5000 点设计的锌指酶ZFN—S3，体内体外实验检测均表明其具有较高的切 效工具。 目的：针对ZFN．S3的切割位点设计、构建核糖体基因区锌指酶 可行性，为该载体联合锌指酶ZFN．S3高效打靶rDNA区奠定基础。 同源序列。然后将无启动子但5’端有EMCV-IRES序列的新霉素磷 酸转移酶(Neo)基因亚克隆至同源序列的rDNAITSl区，利用“启 动子陷阱”策略富集同源重组子。并在Neo基因诱侧加入同向的loxP 位点，用于后续的特异性基因删除。载体pHr2．NL的构建：将pHrl．NL 上rDNA+55 瘤(HTl080)细胞，通过筛选、挑取和计数细胞克隆、鉴定定点整 合等步骤，对其rDNA区的打靶进行研究。 获得的酶切片段大小与理论值相符。2、构建的载体pHr2．NL经 EcoRV、AatlI酶切鉴定，所获得的酶切片段大小与理论值相符。3、 13个抗性克隆，并未获得定点整合克隆。5、采用核转技术将pHr2．NL 并获得了1个定点整合克隆。 结论：构建的含loxP位点的核糖体基因区锌指酶位点靶向载体 ITSl区，为联合锌指酶 pHr2-NL能将Neo基因定点整合至rDNA ZFN．S3高效打靶hrDNA区奠定了基础。 关键词基因治疗，基因打靶，核糖体基因区靶向载体，锌指酶 II ABSTRACT Our researchhad that previous ribosomal suggested DNA(rDNA) locus as serveasafeandeffectiveharborfor anda might transgene non—-viralvector DNA system--ribosomaltargeting been Can various into developed，whichtarget therapeuticgenesmany kindsofhumancell the lines．Byimprovingtargeting locus amore in roleexvivocell—based mayplay important genetherapy, in of cells．Zincnucleasehas especiallygenetargetingprimary finger been usedasa toolto the widely powerfulimprovetargetingfrequencies， evento5000times．As azinc