pcr法鉴别哺动物胚胎性别的研究.pdfVIP

摘 要 Chain 本实验建立了用聚合酶链式反应(Polymerase 哺乳动物SRY特异序列鉴别哺乳动物胚胎性别的方法。依据牛、山羊、兔、猪等哺乳 mol／L 扩增基因组DNA的模板，同时在立体显微镜下收集羊一兔异种克隆胚胎，先用O．145 mmol／LTfis-HCI mmol／LKCl， NaCI冲冼2次，再移入20此胚胎处理液中(t0 pH8．3，50 2mmogL O．45％Tween-20，0．1ttg／I．tL蛋白酶K)，将羊-兔异种 MgCZ2，O．45％NP．40， min，然后将此胚胎溶解物直接作为PCR扩增 克隆胚胎及其处理液在55C水浴作用60 物(每种引物浓度分别为：0．1pmol／L，0．3pmol／L，0．5lamol／L)，dNTPs(浓度分别为： 0．1 IU 模板为公牛基因组DNA(2p．L约100ng)或羊．兔异种克隆胚胎溶解物20I．tL；2 Taq 数为：95℃预变性5min后，按95℃变性1min，58℃退火1rain，72℃延伸1min，进 行30或35个循环后，72℃延伸9min，于4C结束反应。扩增产物在2％琼脂糖凝胶上 电泳，用PCRMarker作分子量标准，紫外灯下观察，最适PCR反应条件为扩增出最强 的SRY产物带而无非特异性扩增带出现时的反应条件。结果表明：SRY引物扩增牛基 因组DNA时，PCR最适条件为：O．1扯mol／LSRY引物，0．1 条件为：0．5I_tmol／LSRY引物，0．1mmol／L mmol／L dNTPs和1．5 Mg“，退 火温度为58℃，循环次数35次。 采用PCR扩增牛基因组DNA最适条件分别扩增了黑白花奶牛9头(早6，63)、 皖北黄牛1l头(早3，6 8)、波尔三羊3只(早2，6 1)、兔4只(早l，63)和猪7 头(早3，6 4)的基因组DNA。所有雄性样品中均出现清晰可见的特异DNA扩增带， 而雌性样品和空白对照中无扩增片段出现。同时采用PCR扩增羊．兔异种克隆胚胎DNA 体为母羊)，所有以公羊为供体的羊-兔异种克隆胚胎样品均出现清晰可见的特异DNA 扩增条带，而以母羊为供体的羊．兔异种克隆胚胎样品和空白对照中无扩增片段出现。 结果表明PCR法可以用来鉴别哺乳动物的性别以及鉴别哺乳动物胚胎的性别，而且用 此法鉴定哺乳动物早期胚胎性别具有相对简单、快速、费用低和准确率高等优点。 本实验还采用设计的性别鉴定引物，按照最优PCR扩增胚胎DNA条件配制了PCR 性别鉴定试剂盒。经实验该性别鉴定试剂盒使用准确性高，可降低污染，方法简便易行， 成本低，在生产实践中有很大的实用价值。 关键词：哺乳动物胚胎PCR法性别鉴定 MammalsWith in onSexIdentificationEmbryos Study Reaction Chain Polymerase Hong Postgraduate：Gui—Yun