鸭坦布苏病毒e白单克隆抗体的制备及间接elisa方法的建立.pdf

摘 要 本研究利用 RT-PCR 方法扩增鸭坦布苏病毒（DTMUV）奉贤株（FX2010）的结 构蛋白 E 基因，并将其克隆至原核表达载体 pET32a，构建重组表达质粒 pET32a-E。 将其转化受体菌 E.coli BL21(DE3)感受态细胞，经 IPTG 诱导进行表达。SDS 和 Western Blot 试验分析表明，E 基因在大肠杆菌中得到了表达，并且可与 DTMUV 鸭阳性血清发生特异性反应，具备良好的抗原性。 本研究利用纯化的 DTMUV 奉贤株 （FX2010）作为包被抗原，建立了检测 DTMUV 血清抗体的间接 ELISA 方法，并对各种检测条件进行了优化。优化后确定的抗原最 适包被浓度为 1.675μg/孔，抗原最佳包被条件为 37 ℃放置 2 h 后，4 ℃下过夜， 血清的最佳稀释度为 1:200，酶标抗体最适稀释度为 1:2 000。在优化条件下，阴阳 性临界值判定标准为 0.432。结果显示，本次试验建立的间接 ELISA 方法具有良好 的特异性、稳定性和敏感性。 本研究利用纯化的鸭坦布苏病毒奉贤株（FX2010 ）免疫 BALB/c 小鼠，利用 淋巴细胞杂交瘤技术，筛选获得 3 株能够稳定分泌抗 DTMUV 单克隆抗体的杂交瘤 细胞，分别命名为：J1-E5-E4 、7B5 和 1E5-B6 ，3 株杂交瘤细胞经腹腔注入同品系 小鼠后产生的抗体 ELISA 效价达到 1:12 800、1:6 400 和 1:25 600 。间接ELISA 和 IFA 结果显示，3 株单抗均可以与 DTMUV 发生特异性反应。进一步研究发现， J1-E5-E4 可以与 DTMUV-E 蛋白结合，使得表达 E 蛋白的 293T 细胞显现出特异性 的绿色荧光；在病毒中和试验中，J1-E5-E4 可以特异性的中和DTMUV ，使其失去 致死鸡胚的能力。 关键词：鸭坦布苏病毒；间接 ELISA ；E 蛋白；原核表达；单克隆抗体 Development of neutralizing monoclonal antibody against Duck Tembusu virus and Establishment of an indirect ELISA Abstract In this experiment ，The E gene of duck Tembusu virus (DTMUV) was amplified by RT-PCR and inserted into the multiple clone sites of the pET32a(+) vector. The recombinant plasmid was transformed into BL21(DE3) competent cells and the cells were induced with IPTG to express the E protein. SDSand Western Blot assays showed that he E protein was successfully expressed and kept the activity for binding the DTMUV-specific antibody. In this experiment ，An indirect ELISA was established using purified DTV (FX2010 isolate) as coating antigen. The reaction conditions were optimized including 1.675 μg/well coating antigen of purified the virus ，1：200 dilution of testing serum and 1 ：2 000 dilution of HRP conjugated anti-duck IgG with cut off-value of. 0.432 (OD450 nm).The results