低氧诱导因子-α介导鼠胚成骨细胞血管内皮生长因子(vegf)表达的实验研究.pdfVIP

低氧诱导因子．10【诱导鼠胚成骨细胞血管内皮生长因子 (VEGF)表达的实验研究． 硕士研究生： 杨峰 孑旨导教师： 汤欣教授 指导小组： 张卫国教授 专业名称： 外科学 摘 要 目的：观察低氧诱导因子．1 induciblefactor．10【，HIF．1(It) G(Hypoxia 在化学诱导的低氧状态下培养的原代鼠胚成骨细胞中的表达变化，并初 步探讨在低氧条件下HIF．1伍对成骨细胞VEGF表达的影响。 方法： 1．在无菌条件下取妊娠19天左右的KM胎鼠颅骨，进行原代鼠胚 成骨细胞的培养，并用“反复贴壁法”对细胞进行纯化，之后对传代第 3代培养的细胞持续计数8天，最后绘制细胞生长曲线，同时对已培养7 天的第4代细胞应用钙．钴染色法检测细胞的碱性磷酸酶，进行成骨细胞 鉴定。 2．取传代第3代培养的成骨细胞，以含125umol／L终浓度氯化钴 的DMEM常规培养液培养不同时间，进行化学模拟缺氧状态，对低氧培 养的细胞在倒置相差显微镜下观察细胞形态，并对细胞进行计数。将培 养不同时间的成骨细胞分别设为0、1、3、5、7天缺氧组。同时，对常 氧培养的第3代细胞设0、1、3、5、7天常氧组 3．采用反转录聚合酶链反应(RT．PCR)技术检测低氧和常氧培养 不同时间的成骨细胞HIF．1a和血管内皮生长因子(qEGF)mRNA的表 达变化。 4．统计学处理：所有的实验都重复三次，实验数据以X±s表示，使 l 用SPSS2．0软件包进行单因素方差分析，以P0．05判断为有统计学差 异。 结果： 1．经组织块法培养的成骨细胞，多呈梭形、三角形，有较多突起，部分 细长突起常跨越细胞与远处的细胞突起相连接；胞核呈圆形或椭圆形，居 中或偏于一侧，轮廓清晰，可见1～3个核仁。从接种后的第1天开始，倒置 显微镜下观察，细胞数量扩增较慢，为细胞生长适应期，以后细胞增长加速， 第6天达到高峰，以后增长速度逐渐减慢，细胞数量开始下降。第4代培养 的细胞碱性磷酸酶钙．钴染色结果显示，细胞质内有黑色颗粒状物质，有少 量分散在细胞周围。计数200个细胞，成骨细胞阳性率为95．5％，阳性细 胞多为梭形和鳞片形细胞，符合成骨细胞的生物学特性。 2．经氯化钴处理后3天，细胞在形态学上可见细胞膜边界不清，细 胞皱缩，胞质致密，核染色质边集；氯化钴处理后7天部分细胞出现凋 亡。对氯化钴处理后的细胞进行计数，可见细胞数量于第5天达到高峰， 但远低于同一时间的常氧组，之后细胞数量迅速降低。 3．反转录聚合酶链反应(RT．PCR)检测各基因的表达变化：通过 凝胶成像系统观察并经Lab．work软件分析可见，经氯化钻处理后， HIF．1 0【和VEGF mRNA的表达随时间的延长逐渐增加(PO．01、)，除第 0天外，均高于常氧组(P0．01)，而常氧组各时间段则无明显变化(P 0．05)： 结论： 1：通过氯化钴化学模拟低氧状态，可以促使成骨细胞表达大量的 0【。 HIF．1 2在低氧条件下，HIF．10【能够诱导成骨细胞增强表达VEGF，从而 可能加强局部血管形成，促进成骨细胞的分化，加速骨形成，促进骨创伤的 修复。可能也为骨缺血，骨坏死，骨折等疾病的临床VEGF基因治疗提 供初步理论探讨。 3．改良的组织块培养法结合了传统的组织块法和酶消化法的优点， 可在较短时间内获得较多的成骨细胞，所培养的细胞具有典型的成骨细 胞形态和功能。 0【 VEGF RT-PCR 关键词：低氧诱导因子．1 成骨细胞 2 VEGF induced induciblefactor—lain byhypoxia