体外角质形成细(hacat)的器官样(气-液交界面)培养.pdfVIP

中文摘要 面)培养 摘 要 目的：角质形成细胞体外培养技术的建立至今已有30 年的历史。从液体浸没培养到空气．液体交界面培养；从单层 细胞培养到复层器官样培养及器官培养，形成了多种培养模 型可供实验研究和临床应用。随着培养技术和皮片鉴定技术 的进步，目前国外已将体外培养皮肤器官成功应用在构建病 毒质粒转染角质形成细胞模型，某些特定皮肤病发病机制及 治疗，病理性皮肤角质形成细胞等众多科研方面。部分组织 工程皮肤产品已取得美国食品与药物管理局的许可而应用 于临床，如：无活性的双层人工皮肤代表：Integra，有活性的双层 在国内相关报道中，虽然也有学者连小华等也将小鼠皮肤皮 块直接进行气一液交界面的培养，并对皮块分化和分层的微 环境进行了一定的探讨和研究，角质形成细胞的器官样培养 仍为少数。本实验将永生化的角质形成细胞(HaCaT)接种 于铺有鼠尾胶原的TransWell培养板套皿，进行气．液交界面 的培养，并用HE染色、免疫组化、流式细胞仪对所培养物 进行鉴定，以明确其分化情况。进而为体外皮肤器官模型的 培养提供一定的实验和理论基础。 方法：人角质形成细胞的浸没培养：将冻存HaCaT细胞 从液氮中取出，投入37℃的水浴中，并轻轻晃动冻存管，使 细胞能尽快融化。将细胞重悬于DMEM完全培养基中，置 中文摘要 于37℃、5％C02温箱中培养，每1．2天更换培养基。当角质 消化液，37℃孵箱中消化lO分钟，按照l：3的比例进行传 代。人角质形成细胞的器官样培养：将I型鼠尾胶原蛋白制 备成PH值为7，浓度为lmg／ml的三维胶原。将其均匀涂至 Transwell培养板套皿的各个膜上，并在使用前将培养板套皿 在37℃孵箱中至少放置1小时。将浸没式培养的角质形成细 胞接种于Transwell培养板套皿的膜上，培养数天至细胞生 长至融合状态。当细胞生长至融合状态，弃掉DMEM培养 基，使细胞处于气．液交界面上。从培养板套皿底部加 中生长至2，3，4周(从细胞上升到气．液交界面诱导分化开 始算起)的细胞分别取出，常规甲醛固定，石蜡包埋。所有 标本均切为59m厚的切片，并进行常规HE染色和免疫组化 鉴定。器官样培养模型流式细胞仪的鉴定：将培养板套皿中 生长至四周(从细胞上升到气．液交界面诱导分化开始算起) 的细胞收集，PBS洗涤3次后制备成单个细胞，75％酒精固 定，流式细胞仪检测。 结果：1．角质形成细胞浸没式培养的形态学观察：角质 形成细胞复苏后接种后到普通培养瓶中，光镜下观察，第1．2 天为缓慢生长期，第3．4天细胞开始加速生长，第5．6天为对 数生长期，细胞快速生长，第6天以后又转为缓慢生长，为 细胞平台期。细胞约7天左右可融合成片，铺满整个瓶底。 2．角质形成细胞器官样培养的形态学观察：使细胞处 于气液交界面上并生长不同的时间，于光镜下观察。当细胞 中文摘要 生长至接种后两周(从细胞上升到气．液交界面诱导分化开始 算起)，光镜下可见角质形成细胞铺满整个培养板套皿的膜， 多数细胞为三角形或多角形的结构，彼此衔接成铺路石样状 态。部分区域角质形成细胞层结构变得复杂，表现为单层角 质形成细胞层上面一些细胞相连成条索状结构，这便是所谓 的复层细胞。细胞生长至第3周，光镜下部分区域的细胞出 现更多的层次。细胞生长至第4周，光镜下部分细胞开始脱 落。 一 3．器官样培养的角质形成细胞HE染色观察：将在 液交界面算起)的细胞分别常规做HE染色，光学显微镜下 观察。2周的角质形成细胞大部分区域为单层结构，部分区 域出现双层结构。3周的角质形成细胞大部分区域为双层结 构。4周的角质形成细胞部分区域出现三层结构。 4．器官样培养的角质形成细胞免疫组化结果：将培养基 液面下降使角质形成细胞处于气．液交界面上诱导分化并培 养至2周，3周，4周的细胞连同高分子膜一块做免疫组化。 结果显示：培养至2周，3周的角质形成细胞均未表达角蛋 白10。培养至4周的角质形成细胞部分区域出现三层细胞， 最上面一层细胞表达了角蛋白lO。 5．器官样培养的角