内质网居民糖蛋kdelc1克隆表达及初步功能研究.pdf

‘＼叭Y㈣1呲7帆8眦吣7吣1叭0＼ll＼7＼11＼ 材料与方法…………………………………………………………………………一64 结果…………………………………………………………………………………65 讨论……………………………………………………………………………………………………………68 结{念……………………………………………………………………………………………………………69 小结与展望………………………………………………………………………………一70 参考文献…………………………………………………………………………………．．7l 综述…………………………………………………………………………………………………………………．73 致谢………………………………………………………………………………………………87 原创性声明…………………………………………………………………………．．88 内质网居民糖蛋白KDELC1克隆表达及初步功能研究 研究生：王兴翠 专 业：内科学 导 师：马丽霞教授 中文摘要 目的 1．构建糖基转移酶KDELCl新基因的原核表达载体，诱导融合蛋白表 达，并对其进行纯化，制备融合蛋白多克隆抗体。 2．明确该糖基转移酶在肝细胞内的表达定位及组织分布。 3．探讨KDELCl表达变化对HepG2细胞周期可能的调节作用。 4．探讨内质网应激过程中该蛋白表达变化特征。 5．探讨该蛋白在肝细胞损伤中的调节作用。 、 方法 ’ 1．克隆、表达KDELCl融合蛋白。 应用逆转录聚合酶链反应(Reverse PCR，RT-PCR)技术， transcription 化大肠杆菌E．coli 酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)法和免疫印迹(Westernblot)法，分析验证融 合蛋白表达的特异性。随后大量诱导该蛋白表达，利用亲和层析法对表达蛋 白进行纯化。 2．制备KDELCl的多克隆抗体。 以纯化的融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔，获得多克隆抗体。同时 以免疫前后的兔血清作为一抗，利用Westernblot技术和ELISA方法对多克 隆抗体进行特异性分析和效价检测。 3．构建KDELCl细胞内定位载体。 扩增KDELCl全长CDs，将全长片段插入至绿色荧光蛋白真核表达载体 1 居 利 4． 利用上述制备成功的KDELCl多克隆抗体，采用免疫组织化学技术，观 察分析KDELC l在肝脏、肺、肾脏、脾脏、胃、乳腺、淋巴结、直肠组织中 的分布特征。 5．构建、筛选KDELCl干扰质粒。 、时荧光定量PCR(real—time FPmir．KDELClshRNA)。 6．分析KDELCl表达变化对细胞周期的影响。 1-KDELC 1． 分别利用pEGFP—C 析KDELCl高表达和低表达对细胞周期的影响。 7．初步探讨KDELCl在内质网应激中的作用。 利用衣霉素刺激HepG2细胞，建立细胞内质网应激模型。分别利用 Westernblot、real．time PCR法，检测内质网应激过程中KDELCl蛋白水平 和mRNA水平的表达变化情况。 8．初步探讨KDELCl在临床肝损伤中的作用。 收集临床肝功能异常血清标本及正常对照血清标本，利用ELISA技术包 被酶标板，采用上述制备的KDELCl多克隆抗体，分析该蛋白在肝损伤过程 中可能的变化情况。 结果 1．成功获得KDE