转导人端粒酶逆录酶基因致人骨髓间充质干细胞永生化的研究.pdfVIP

转导人端粒酶逆转录酶基因致人骨髓间 充质千细胞永生化的研究 硕士生姓名： 张志勇 指导教师： 齐志明 教授 专业名称： 外科学 摘 要 目的 人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)可被诱导分化为多种细胞， 被认为是组织工程种子细胞的重要来源。在体外培养时，hBMSCs寿命 有限，随传代次数增加其分化能力逐渐丧失，这限制了其在组织工程中的 研究和运用。转基因技术迅速发展，使永生化细胞建立成为可能。本研 究通过逆转录病毒载体将外源人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因转入人 骨髓间充质干细胞中，以建立永生化的人骨髓间充质干细胞。 方法 通过脂质体将含有hTERT基因的逆转录病毒载体 1 1．hTERT)转入包装细胞PT67，G48筛选出表达病毒的阳 (pLEGFP—C 性细胞克隆。选取3个细胞克隆，各自进行扩增培养。通过NIH3T3对 选取细胞的上清进行病毒滴度测定，确定最高病毒滴度。提取并扩增 l8筛 选感染后的细胞，选取3个单克隆分别进行扩增培养。通过RT．PCR和 Western 导前后hBMSCs生长曲线，观察hTERT基因转入后对细胞增殖的影响。 克隆形成实验和裸鼠致瘤实验对hTERT．hBMSCs致瘤性方面进行研究。 结果 通过RT．PCR和Western 态学上和hBMSC一样呈长梭形，但是由于转导有EGFP基因，前者有绿 色荧光蛋白表达。通过流式细胞仪检测转导前后hBMSC表面抗原标记： CD29，CD71，CD106，CD45和CD34，结果为前三项抗原都是阳性， 后两项为阴性。在功能学方面，通过向软骨细胞诱导，免疫细胞化学检 测到转导前后的细胞都呈棕黄色，说明有软骨细胞特异性标记II型胶原 hBMSCs细胞克隆形成不仅数量少，而且细胞生长状态差，克隆形成率 为0．83％和O．67％，低于正常细胞克隆形成率1％，而对照组恶性黑色素 瘤细胞克隆数量多，细胞生长状态好，克隆形成率为57．4％，远远高于 肿瘤细胞克隆形成率10％。在裸鼠致瘤实验中，阳性对照恶性黑色素瘤 细胞接种于裸鼠背部皮下，三周后局部就形成的肿块，HE染色为恶性黑 色素瘤细胞，而注射有hTERT．hBMSCs的部位观察两月未见肿物形成， 局部皮下组织HE染色为皮下疏松结缔组织。 表面标记和分化功能，保持其向软骨细胞分化的能力。hTERT基因转入 使hBMSCs端粒酶活性被激活，其细胞寿命延长。hTERT基因转入使 hBMSCs没有向恶性转化。研究证明成功地建立功能正常的永生化 hBMSCs，可为组织工程种子细胞的来源提供一种途径。 关键词：入骨髓间充质干细胞 端粒酶逆转录酶 永生化 The theimmortalizationofhumanbone of study marrow stemcells human by mesenchymal transducting telomerasereverse transcriptasegene Master degree candidate：ZhiyongZhang Supervisor：Prof．ZhimingQi Maj or：surgery Abstraet bonemarrow stem Ob