靶向hbv xsirna和甲基化抑制剂抗肝细胞癌的作用及机制研究.pdf

靶向HBVX的siRNA幂fl甲基化抑制剂抗肝细 胞癌的作用及机制研究 专 业：内科学(感染病学) 学位申请人：邝建玉 指导老师：杨林副研究员 中文摘要 研究背景 原发性肝细胞癌(Hepatocellular 一，以肿瘤细胞增殖能力强、全身转移快以及疾病早期缺乏特异性临床症状为特点， 预后较差。传统抗肝细胞癌药物治疗效果差，手术治疗5年生存率也仅50％，有必 B 要探求新的有效的抗肝细胞癌的生物治疗手段。全球乙型肝炎病毒(hepatitis 主要危险因素，但HBV致癌的具体机制尚不很清楚。 BvirusX 乙型肝炎病毒X基因编码的X蛋白(hepatitis 感染和复制过程中必须的多功能病毒蛋白质，并可能直接诱导肝细胞癌变。Koiko 等将X基因转入CD一1小鼠胚胎细胞，84％小鼠肝脏发生了肿瘤并伴有HBx的高表 达。在HBV相关的肝细胞癌组织中，HBx的表达明显升高，但HBV的其他蛋白未 见明显升高。近年来也有研究表明HBx与肝癌细胞转移及肝癌组织中的血管形成有 密切关系，这些都为HBx诱导肝细胞癌变提供了直接的证据。因此，本课题以HBV X基因为靶点，采用RNA干扰(1Ⅲ加)技术特异性阻断X基因的转录表达，研究 其能否抑制肝癌细胞生长，以探讨肝细胞癌的生物治疗新方法；同时也迸一步阐明 HBx蛋白诱发肝细胞癌变的机制。 对比正常的肝组织，原发性肝细胞癌组织及肝脏癌前病变组织中p16Ⅳ“A、 SOSC．1及APC基因甲基化明显升高，并且抑癌基因启动子区域CpG岛异常甲基化 导致p16NK4A等抑癌基因失活是肝细胞癌变的重要机制之一。5．氮．2’．脱氧胞苷可以 结合进细胞DNA中，特异性抑制DNA甲基转移酶的活性，使普遍存在的DNA甲 基化降低。2006年美国食品药品监督局批准5．氮．2’．脱氧胞苷作为特异性的DNA 甲基转移酶抑制剂用于治疗与DNA甲基化有关的骨髓增生异常综合症，这为研究 5．氮．2’．脱氧胞苷作为肝癌的治疗手段提供了新的思路。 X的siRNA 为寻求HBV相关肝细胞癌的生物治疗手段，本课题研究靶向HBV 和甲基化抑制剂5．氮．2’．脱氧胞苷单独或联合使用对肝癌细胞及裸鼠肝癌移植瘤生 长的作用并探讨HBx蛋白诱发肝细胞癌变的可能机制。 研究目的 1、明确靶向HBVX的siRNA和甲基化抑制剂对HBV相关肝癌细胞生长的抑 制作用及机制，以探讨肝细胞癌的生物治疗手段。 2、探讨HBx蛋白诱发肝细胞癌变的可能机制。 实验方法 以稳定表达GFP／HBV 靶向adr亚型HBV RT．PCR法测定siRNA处理细胞的HBV X基因表达；MTT法检测HepG2／GFP、 种于裸鼠皮下，观察两组裸鼠皮下移植瘤生长情况；进一步将HepG2／GFP．HBx细胞 (1．0×107个／ml，0．2ml／只)接种于裸鼠右侧背部皮下建立移植瘤，待皮下移植瘤长至 约4×4mm大小时随机分成5组并相应处理，分别为X—siRNA处理组(移植瘤局部注 合用药组；对照组(生理盐水腹腔注射每天1次，连续3天)及对照siRNA组(移植 Ⅱ 理后皮下移植瘤的生长情况。甲基化PCR检测各组细胞及移植瘤组织标本p16刑K4A 基因甲基化。Western 统计分析，根据方差齐性检验结果，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较 用LSD．t检验，PO．05认为差异有统计学意义。 实验结果 XmRNA水平明显降低； (n_5，p0．05)；RT．PCR显示X．siRNA处理的细胞HBV 裸鼠皮下移植瘤实验显示HepG2／GFP．HBx组的皮下移植瘤体积明显大于 无明显差异。 组织中p16NK4A基因甲基化减低。Western 白水平高于