泛素特异性蛋白USP46的错义突变A81V和T187P与ADHD的关联性研究.pdf

中文摘要 与ADHD的关联性研究 摘 要 目的：泛素．蛋白酶体通路(ubiquitin．proteasomepathway)通过泛素 与靶蛋白赖氨酸残基的结合来参与调控生物体内多种重要进程，包括细 胞膜转运，组蛋白修饰，转录调控，DNA的修复及复制等。溶酶体系统 和泛素蛋白酶体通路共同构成细胞内蛋白质降解的主要途径。与蛋白质 磷酸化和去磷酸化一样，泛素化和去泛素化是一个被严格调控的可逆过 程，其中去泛素化酶(DUB)是调控中的一个重要环节。泛素特异性蛋 白酶(USPs)是去泛素化酶成员中最多的一类，它通过去除靶蛋白上的 泛素分子来对蛋白质的泛素化进行负向调节。研究发现多种去泛素化酶 与神经系统病变等众多疾病的发生有密切的关系。USP46是本课题组克 隆成功的泛素特异性蛋白酶，位于4q12，编码366个氨基酸。 Test，TST)和强迫游泳试验(ForcedTest，FST) Suspension Swimming 中是调节小鼠不动行为的数量性状基因。usp46第92号赖氨酸的缺失后小 鼠的不动时间明显缩短，因此他们提出去泛素化酶USP46与小鼠的行为 抑郁有关。而我们课题组在克隆出“印96的同时也证明了usp46的第92 号赖氨酸缺失后，其去泛素酶活性降低为野生型的27．04％。 本课题通过构建USP46错义突变A81V、T187P的表达质粒和去泛素 1V、T1 化酶活性检测体系，分析A8 87P对酶活性的影响。同时，通过建 立USP46错义突变的基因分型方法，在中国汉族人群和儿童注意缺陷多 动障碍(Attention Deficit／Hyperactix，ity A81V、T1 87P突变进行初步筛查，为进一步的分子流行性学研究奠定基 础。 方法： T1 1 1 87P，pGEX-usp46-T87P，pGEX—usp46一A8 中文摘要 号半胱氨酸定向突变为丝氨酸；A81V为81号丙氨酸定向突变为缬氨酸； T187P为187号苏氨酸定向突变为脯氨酸)。 Ub52为模型底物检测USP46 Resin纯化蛋白系统纯化GST融合蛋 阳性对照。经GSH．Sepharose．TM 用Od、，ssey双色红外激光成像系统分析野生型和突变型的活性差异。用兔 抗T7多克隆抗体检测融合蛋白T7．USP的表达情况。 Ub．Met．p—gal为模型底物检测USP46 质粒共转化BL21感受态细胞，研究去泛素化酶野生型及突变型将模型 突变型的去泛素化活性。去泛素化酶L33P2作为阳性对照。用小鼠抗B— 度的比值)，采用Od)，ssey双色红外激光成像系统分析野生型及突变型活 性差异。 (4)收集健康人群及ADHD患病儿童的血液样本。 (5)建立去泛素化酶usp46{昔义突变基因检测方法。提取血液样本 1V、T1 中的基因组DNA。分别设计扩增A8 87P位点的特异性引物，确定 扩增特异性DNA片段的PCR反应参数。 1V、T1 A8 87P目的片段进行测序分型。 (6)将特异扩增t)匀usp46 (7)利用DNAStar矛HChromas软件对结果进行分析。 结果： (1)构建出usp46突变质粒pACT7．usp46．T1 T1 87P、pGEX．usp46．ASl 中文摘要 正确。 42kDa，与预期大小一致。USP46野生型和A81V突变型成功：I,哿GST-Ub52 切断，产生大小约为36kDa的产物，而突变型A81V切断底物的