拉米夫定治疗慢性乙型肝炎疗效和基因变异的研究.pdfVIP

(1)引物设计：用DNA STAR软件，依据HBV DNA (AFl00309)P基因设计了3条引物，分别命名为HBV381、 HBV840、HBV801，序歹0分另0为5-TGCGGcGTllTATCATCTTCCT- 3’、5’一G7n_rAAATGTA7IACCCAAAGAC一3’、5’一CAGCGGCATAAAGG- GACTCAAG一3 7，配成两对半巢式PCR引物：HBV381／HBV840、 HBV381／HBV801。用于测序的引物为HBV381。 (2)DNA纯化试剂盒和测序反应试剂盒。 (3)PCR扩增仪(ABI Gene Amp PCR System 2400)。 (4)PCR扩增仪(ABI Gene Amp PCR System 9600)。 (5)自动序列测序仪(ABl377)。 二、实验方法： 1．处理血清，提取HBV DNA。 2．半巢式PCR： (1)第一次扩增：反应体系50ul，产物453bp，反应过程为： 94T145秒、50℃30秒、72(2 1分钟30秒，共30个循环。 (2)第二次扩增：反应体系50ul，产物415bp，反应过程为： 94℃45秒、55℃30秒、72℃1分钟，共30个循环。 (3)用DNA Markers验证半巢式PCR产物。 3．PCR产物纯化、测序反应、沉淀及自动测序。 4．数据处理： (1)总结拉米夫定的疗效、P基因变异出现的时间，用SAS软 件分析影响疗效和变异的因素。 (2)用DNA STAR软件的CLUSTAL V方法对HBV DNA P基 因片段的种系发生、核苷酸和氨基酸差异、变异类型进行分析。 (3)用DNAclub、DNAsis软件分析出现P基因变异前后所编 码的蛋白质的二级结构的差异。 ·2· 实验结果 1．拉米夫定治疗效果：按照ALT正常值最高上限(ULN)，把 试验组分成4组：≥5 XULN、2．5×ULN、1-2 XULN、≤1ULN。如表 2所示，各组间促进ALT正常化没有明显差异。在治疗后12个 月，HBeAg转阴率随着治疗前ALT水平的升高呈直线上升，比率 为72．4l％(21／29)；但是HBeAg血清转换(HBeAg(一)、HBeAb (+))率却随着治疗前ALT水平的升高呈直线下降，比率为13． 79％(4／29)；未发现HBsAg血清转换及转阴。在治疗后6个月血 清标本中未发现YMDD变异，在治疗后12个月血清标本中发现2 例YMDD变异。 2．基因分型：对照组和试验组经半巢式PCR扩增后，对照组 20个标本检出17个阳性，试验组用药前33个标本都为阳性，治 疗后6个月、12个月分别有22个标本阳性。如图2、表3所示：试 验组治疗前和对照组检出B、c、D三个基因型，分别占22％、50％、 28％(P=0．000)；未发现基因型A、E、F、G、H。基因型D的分布 与基因型B相当，其中在慢性HBV携带者中基因型D的分布仅 次于基因型C，并且高于CHB患者中基因型D的分布。 3．YMDD变异：在对照组中发现了1例L528M变异；在拉米 夫定治疗后6个月中未发现YMDD及L528M变异；在拉米夫定治 疗后12个月发现了2例YVDD变异，这2例YVDD变异都伴有 L528M变异，还发现了2例只有L528M的变异。 4．基因型对拉米夫定治疗的影响：如表4所示：基因型B在 ALT正常化和HBeAg血清转换中的比率最高；基因型c在HBeAg 转阴率和HBV DNA转阴率中的比率最高，但2例YVDD变异都 发生在基因型C中；基因型D在ALT正常化、HBeAg转阴率、 HBeAg血清转换率、HBV DNA转阴率都占一定的优势。 ·3· 5．预测YMDD变异株与HBV野生株编码的蛋白质二级结 构：如图4所示：在截取的氨基酸序列中YMDD对应的是70- 73AA，L528M对应的是47AA；在用药前未发生变异时47AA和 70-73AA蛋白质的二级结构都为转角，在发生变异后，70-73AA的 转角结构变为折叠，47AA的转角结构没变。 讨 论 在本研究中，HBeAg血清转换率只有13．79％，与Lai对亚洲 患者拉米夫定治疗一年的HBeAg血清转换率16％相近，比Schalm 和Dienstag的研究结果低。Chen的研究发现治疗前的ALT水平 高低可独立预测HBeAg血清转换，PemHo汇聚世界各地4个随机 研究结果，分析后也得到相似的结论。在本研究中HBeAg转阴有 相似的结果，但HBeAg血清转换则正相反，说明治疗前的ALT水 平不足以预测HBeAg血清转换。 到目前HBV分为8个基因型：A、B、C、D、E、F、G、H。分型方 法也得到改进。HBV基因型的分布，有显著的地域差异。并且不 同基因型在致病性，对药物敏感性及基因变异方面均有差异。依 据H