枸杞多糖对小胶质细胞HSP60―TLR4通路的抑制作用.docVIP

枸杞多糖对小胶质细胞HSP60―TLR4通路的抑制作用 　　摘要：本文为研究热休克蛋白60（HSP60）在枸杞多糖（LBPs）神经保护中的作用机制，采用的方法是培养小胶质细胞株BV2，实验分对照组、阳性对照组（细菌脂多糖，LPS）、实验组（LBPs）。应用western-blot检测LBPs对LPS激活的BV2细胞HSP60和Toll样受体4（TLR-4）的影响，ELISA方法检测LBPs对HSP60释放和细胞因子产生的作用。结果显示，LPS组中HSP60和TLR-4的表达及TNF-α和IL-1β的释放都比对照组显著增加，加入LBPs后，这些因子的水平都明显降低。由此得出结论，LBPs可能通过HSP60-TLR-4途径阻止小胶质细胞的活化而发挥神经保护作用。 　　关键词：热休克蛋白60;枸杞多糖;TLR-4;小胶质细胞 　　中图分类号：G642 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2015）47-0247-02 　　 热休克蛋白是一类应激蛋白，对机体具有保护作用。但是近年来的研究表明，细胞内过量表达的热休克蛋白60（HSP60）会释放到胞外，激活自身的Toll样受体-4（TLR-4），导致TLR-4信号通路激活，引起细胞凋亡[1，2]。枸杞是我国传统的名贵中药材，尤其以宁夏枸杞最为著名，素有“红宝”美称。枸杞多糖（LBPs）是从枸杞中提取的一种水溶性多糖，是枸杞的主要活性成分，具有降血脂、抗脂肪肝、抗衰老、抗肿瘤等多种生物学功能[3]。虽然LBPs的生物和药理作用已为人们逐渐认识，但是，关于LBPs对神经系统的作用的研究还很少有报道。本课题以小胶质细胞为靶细胞，探讨了LBPs对细菌脂多糖（LPS）激活的小胶质细胞的神经保护作用及其信号通路。 　　一、材料与方法 　　（一）材料 　　枸杞多糖购自宁夏启元药业;HSP60抗体购自ENZO公司;TLR-4及GAPDH抗体购自Abcam公司;全蛋白提取试剂盒购自凯基公司;蛋白定量BCA试剂盒购自Thermo公司;DMEM培养基和胎牛血清为Hyclone公司产品;LPS购自Sigma公司;ELISA试剂盒购自欣博盛公司。 　　（二）方法 　　1.BV2小胶质细胞的培养。BV2小胶质细胞在含10%胎牛血清的DEME培养基，37℃，5%CO2培养箱中培养。用无菌的0.01%PBS充分溶解枸杞多糖。LPS（1μg/ml）处理BV2小胶质细胞30min后，分别加入600μg/ml的枸杞多糖溶液，孵育24小时后，收集细胞及上清液。 　　2.Western blot检测蛋白表达。药物处理完毕，用全蛋白提取试剂盒提取各组蛋白并收集上清液，BCA法进行蛋白定量，取等量蛋白，10% SDS分离后将蛋白转至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭膜2h，一抗4℃孵育过夜，TBST充分洗涤膜后用二抗室温孵育1 h，ECL试剂显色成像。以GAPDH作为内参照。 　　3.ELISA检测细胞因子的表达。应用ELISA试剂盒，按照试剂盒的操作步骤，分别测定各组培养液上清中的TNF-α、IL-1β的表达，最后在酶标仪上540nm处测定各孔光密度值（OD）。 　　4.统计学分析。采用SPSS11.5进行统计学分析。实验数据用x±s表示，组间比较用方差分析，进一步比较两两间差异采用Student-Neuman-Keuls Test方法。 　　二、结果 　　（一）枸杞多糖抑制LPS激活后的小胶质细胞中的HSP60的表达及释放 　　Western blot结果显示，与对照组相比较，LPS激活后的小胶质细胞中HSP60的表达明显上扬，而枸杞多糖可显著抑制LPS引起的HSP60的增加，差别具有统计学意义（Plt;0.05）（图1A）。ELISA结果显示枸杞多糖处理后，由LPS引起的HSP60的胞外释放量明显地被降低了（图1B）。 　　A为western blot结果，实验分为对照（con），LPS组，实验组LBPs，以GAPDH为内参。B为枸杞多糖处理24小时后，ELISA检测的细胞培养液中HSP60水平。各组实验中，LPS组相对于con，均具有显著性差异。枸杞多糖实验组相对于LPS组，具有显著性差异，plt;0.05. 　　（二）枸杞多糖抑制激活的小胶质细胞中的TLR-4的表达 　　Western blot结果表明，与对照组相比较，LPS处理后的小胶质细胞中TLR-4的表达明显增加，在枸杞多糖处理的实验组中，TLR-4的表达显著下降，差别有统计学意义（Plt;0.05）（图2）。 　　（三）枸杞多糖抑制了激活的小胶质细胞的细胞因子的表达 　　用ELISA试剂盒检测了不同分组中TNF-α、IL-1β细胞因子的表达。实验结果表明，LPS刺激后的BV2小胶质细胞中的TN