动植物油脂－生育酚及生育三烯酚含量的高效液相色谱测定法.docVIP

前 言 本标准等同采用ISO 9936：2006《动植物油脂－生育酚及生育三烯酚含量的高效液相色谱测定法》（英文版）。 为便于使用，本标准做了下列编辑性修改： ——“本国际标准”一词改为“本标准”； ——用小数点“.”代替作为小数点的逗号“，”； ——删除了国际标准的前言。 本标准由国家粮食局提出。 本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。 本标准起草单位： 本标准主要起草人： 本标准首次制定。 动植物油脂－生育酚及生育三烯酚含量的高效液相色谱测定法 1 范围 本标准规定了测定动植物油脂中游离α-、β-、γ-、δ-生育酚及生育三烯酚含量的高效液相色谱法。 对于含有生育酚酯及生育三烯酚酯的产品，有必要先对其进行皂化处理。 注：在附录B（资料性）中描述了包括低温皂化方法的适宜方法。 2 规范性引用文件 下列标准中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，使用本标准的各方应研究是否可使用下列标准的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 ISO 661 动植物油脂 测试样品的制备 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 生育酚含量 tocol content 用本方法测定的各单体生育酚质量的总和。 注：含量以毫克每千克来表示。 4 原理 将测试样品溶解在正庚烷中，通过高效液相色谱将各单体生育酚分离。用标准溶液中测定的校正参数计算每种生育酚的含量。 5 试剂 试剂均为色谱级或相同等级。 5.1 α-、β-、γ-及δ-生育酚和生育三烯酚标准物质。 若无生育酚标准物质，可用小麦胚芽油和大豆油混合物鉴定α-、β-、γ-及δ-生育酚。 若无生育三烯酚标准物质，可用棕榈油鉴定α-和γ-生育三烯酚。测得的色谱图可以帮助鉴定测试样品中的色谱峰，在这种情况下，应使用相应生育酚校正参数。 注：α-、β-、γ-及δ-生育酚及生育三烯酚标准物质可以选择Merk1。α-生育酚标样产品较多，据报道其纯度在85%～100%之间，因此有必要用紫外分光光度计（见9.1.1）测定所配标准溶液的浓度。 5.2四氢呋喃：用HPLC尼龙过滤器过滤（0.45μm）。 5.3正庚烷：用HPLC尼龙过滤器过滤（0.45μm）。 5.4高效液相色谱流动相： 任何一种混合溶剂，只要可以使色谱峰的分离度达到表2（生育三烯酚的相对保留时间）和附录A（植物油混合物色谱）的要求，即可用于本标准（见表C.3）。 一种适宜的流动相体积分数3.85%四氢呋喃正庚烷溶液：用量筒（6.5）量取1 000 mL的正庚烷置于2L的瓶中。用20mL移液管（6.6）添加两次20 mL四氢呋喃（5.2）。混匀后超声均质15 min（6.8）。 5.5 甲醇。 6 仪器 除常用试验仪器外,还包含以下仪器： 6.1 高效液相色谱系统:由一个高压泵，一个样品注射器，可自动调温至25℃（优化选择）的柱温箱，一个激发波长可调节为295 nm及发射波长可设置为330 nm的荧光检测器和一个记录仪组成。 推荐使用荧光检测器，若无荧光检测器，也可以使用紫外检测器。如果使用紫外检测器，波长应设置为292 nm。 高效液相色谱分析柱，以下两种可选： ——250 mm×4 mm，填充平均粒径约为5μm的二醇基硅胶， ——250 mm×4.6 mm，填充平均粒径约为5μm的硅胶。 注1：二醇基硅胶柱可用售5μm粒径的LiChrospher 100 Diol 作为填充物，硅胶柱可用售5μm粒径的LiChrosob SI 60 and Kromasil 100 作为填充物2。当样品中含有β-生育三烯酚时，优先考虑使用二醇基硅胶柱，因为使用硅胶柱时γ-生育三烯酚和β-生育三烯酚被同时洗脱。 注2：根据使用的高效液相色谱技术，柱的长度和直径可以变化。 6.3 紫外分光光度计: 能在精确波长处准确测定。用10 mm比色皿。 6.4 旋转蒸发器。 6.5 量筒:1 000 mL。 6.6 移液管:5 mL，10 mL和20 mL。 6.7容量瓶:50 mL和25 mL。 6.8超声器。 7 取样 所取样品应具有代表性。在运输储藏过程中样品未发生变化或破坏是至关重要的。 取样不是本标准中规定的部分。ISO 5555中推荐了取样方法。 8 样品制备 如果样品为液体，按ISO 661要求将样品混合均匀，但是不能够过滤。 如果样品是固体，取具有代表性的部分样品（不少于样品的10%）于烧杯中，在不超过40℃的水浴中熔化，并轻微振荡混匀。 样品制备应避免阳光直射，尽量在光线柔的条件下进行。 9 操作步骤 通常，在分析过程中生育酚的氧化可能导致实验结果偏低。氧化率随着碱金属、热和光的