对烟草粉螟高毒力Bt伴孢晶体的特征与SDSPAGE分析.pdf

对烟草粉螟高毒力Bt伴孢晶体 的特征与sDS．PAGE分析‘ 高家舍1．李梅云‘，李天飞2，宋春满1，廖文程1．王革2 (1．云南省烟草科学研究所，云南玉溪6出100；2．云南玉溪红塔集团。云南玉溪653100) 摘要：采用液体双向分离法分离提纯苏云金杆菌B133，B63、BtHB伴孢晶体，Bb3、Bt53、刚粕分离纯 度分男l达蜉．93％、鲫，9％、99．8％。扫描电镜和透射电镜观察发现，3个菌株均有菱形、长椭圊形、不规 则形晶体。个别有方形，步部分长椭躅形晶体为不标准椭圆形，带有“拖尾”或突起；不同菌株在晶体形 状和数璧组成上有所不同，B133菌株菱形晶体占话％，长方形与椭圆形晶俸占22％一23％．B153菌株长椭 圆形晶体占90％．菱形晶体占5％，不规舞请形占5％，BlHB藩株菱形晶俸占30％．长错圆形为64％一酪％， 方形5％；晶体大小不均一。以鲫s_聚丙烯酰胺凝腔电泳分析了3个对烟草粉螟高毒力苏云金芽孢杆菌的 伴孢晶体。结果发现3个菌株的电泳图谱不同，Bt33有2条清晰带，分予量分别为43kD，15kD．B出B菌株 色淡。sDS—P“E分折表明，一个既荫株有几种不同的晶体蛋白．不尉菌株晶体蛋白的种娄有所同亦有所 不同。 关键词：苏云金杆菌；伴孢晶体；提纯；形态特征；SDs_P^GE 烟叶在陈化、贮存及整个烟草制品加工销售过程中．都会受到仓储害虫烟草粉螟 (跏h哪妇h‘融缸)和烟草甲(￡di诎mo∞m幻n)的为害，严重影响烟叶品质。近年来，一 些仓储物品的熏蒸剂和保护剂已逐渐淘汰，烟仓中由于烟草甲对磷化氢的抗性而导致防治失 败的情况已见报道…，开发新型元公害杀虫剂势在必行。苏云金杆菌(鼬ci如s抽z砌应nsi) 是一种生物防治剂，在芽孢期特异产生由蛋白质组成的不同类型的伴孢晶体，是昆虫致死的 主要因子之一，分别对鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫以及螨类和动植物寄生线虫有毒性f“。 为了解伴孢晶体的类型与其对烟草仓储害虫毒力之间的关系，作者就本室筛选的对烟草甲与 烟草粉螟毒力高的3个Bt菌株的晶体蛋白进行了研究。 l枋料与方法 1．1供试材料 供试培养基为NA培养基，供试菌株Bt33、Bt53、BtHB由本室分离、筛选并保存。 1．2菌悬液的制备 各菌体先用液体培养基振荡堵养72h，涂布接种子固体平板，置30℃下培养t6天(以 生成较厚的菌苔为标准)。用无菌水刮洗菌苔，经纱布过滤，收集菌液，在4000r／rnin下离 心20嘶n，去上清液。将沉淀物(芽孢与晶体混合物)用蒸馏水洗涤二次，0．5mL／LNacl洗 Naa+O+01％Thton 涤一次，均经离心收集沉淀物，最后将得到的沉淀用lrr出L x—loo配 成O+07∥IId的悬液，置冰箱4℃保存备用。 1．3晶体的提纯 将洗涤过的菌悬液(O，07∥Ⅱd)。置磁力搅拌机上搅拌，用小药勺刮去泡沫，反复多次 ·作者简舟：高象台(I卵l一)．云南省烟草科学研究所。助理研究员．主要从事烟草贮埔害虫研兜。 云南省科技厅。十五”攻关(200I黼)和云南省烟草公司(Ol^嘶)项目资助。 对烟草粉螟高毒力Bt伴孢晶体的特征与sDs_PAGE舟折 97 至泡沫较少为止。 去泡沫后的菌悬液，在烧杯内按7：6：7(v／v／V)比例加入l％N82sq和cCh，充分振 荡15T|lin后，静置15商n。这时菌悬液为水相(上层)与有机相(下层)，用药勺刮去水相表 面浮的泡沫，再用注射器小心收集水相。靠近有机相的水相，单独取出．再用上法进行第二 次双相分离。将多次双相分离的水相．20000r／n血离心lO“n，去上清液。沉淀物用无离子 水离心(20000r／耐n，lOmin)洗涤二次后．冻干保存，即得冻千晶体制剂。每种晶体标本均 做涂片2张，染色后光镜检查10个视野，计数晶体与污染的芽孢及孢子襞，最后得出晶体 纯度。 1．4电镜观察 1．4．1扫描电镜样品的制备将提纯的晶体。以5％的丙酮洗涤3次，再用双蒸水洗涤离心 3次，将样品悬漓液在玻片上，自然干燥。将干燥好的样品在解剖镜下黏在铜台上，喷镀金 ’ 膜，在扫描电镜下观察并拍照记录。 1．4．2透射