结核杆菌利福平与异烟肼耐药基因快速检测用参考品的制备.pdfVIP

中罔生物制品学杂志2006年7月第19卷 ，4期 Chin J Biologicds July 2006，VoI．19 4 【诊断制品】 结核杆菌利福平与异烟肼耐药基因快速检测用参考品的制备 陈保文’ 沈小兵 苏城’ 王国治’ 景奉香 【摘要 】 目的 建立结核杆菌利福平与异烟肼耐药基因快速检测用国家参考品。方法 收集分枝杆菌菌株，用经典的 药敏试验及培养基鉴别试验进行鉴定；用分子生物学技术对耐药菌株的耐药基因进行核苷酸序列分析，并进行突变位点的筛 选；选取完全耐药菌株，用膜过滤法制备单细胞菌液，进行显微计数。结果 选出阳性参考品符合率检测用、含不同突变位点 的结核分枝杆菌耐药菌株20侏；阴性参考品符合率检测用菌株10株，其中敏感菌株5株，致病性非结核分枝杆菌菌株5株； 最低检出量检测用结核分枝杆菌耐药菌株5株，制备浓度为1×10 个／ml的单细胞菌液。结论 该参考品可以用作结核菌 利福平与异烟肼耐药基因快速检测试剂质量的标准。 【关键词】 结核杆菌；药敏试验；耐药基因；参考品 结核病发病率近年来逐步上升的原因之一是耐 酸(PNB)、利福平(RFP)、异烟肼(INH)等均由 药菌株的产生与播散。1990年，我国结核病流行调 Sigma公司生产。 查结果表明，临床分离株原发耐药率为28．1％，继 2．3 分子生物学检测试剂：由中国科学院上海 发耐药率为41．4％川，因而对耐药结核病的控制与 微系统与信息技术研究所合成并提供。 检测已成为当今结核病研究的热点。经典的药敏试 3．菌种制备及鉴定 验方法繁琐费时，应运而生的是许多简便、快速的分 3．1 初始菌种制备：将收集的临床分离菌株接 子生物学耐药检测技术。为使新的耐药检测技术标 种于改良罗氏培养基上，37℃培养3—4周。将新鲜 准化与产业化，建立相应的检测用参考品是当前耐 培养物中加入稀释苏通液，研磨制备菌悬液，分装于 药结核病防治的迫切需要。为此，我们制备了供结 塑料小管中，一7O℃冰冻保存。 核菌利福平与异烟肼耐药基因快速检测用的国家参 3．2 菌种鉴定：参照《结核病诊断细菌学检验 考品。由于链霉素、吡嗪酰胺等的药敏试验方法难 规程》(中国防痨协会，1995)中结核分枝杆菌复合 以标准化，以致耐药结果难以确证，因而供其检测用 群与非结核分枝杆菌菌种鉴别法进行。取出一70~C 参考品有待下一步研究制备。 保存菌种，接种于改良罗氏培养基上，37~C培养3— 4周，刮取菌落，放入玻璃研磨器中研磨至呈乳酪 材料与方法 样，以稀释苏通液稀释，与麦氏标准比浊管比浊，配 1．菌株来源 制成1 mg／ml的菌悬液，并稀释制备10 mg／ml的 结核病临床分离菌株893株，由北京胸科医院、 接种用菌液。于对硝基苯甲酸(PNB)培养基、噻吩一 北京胸部肿瘤结核病研究所、上海疾病控制中心、浙 2一羧酸肼(TCH)培养基以及不含药的改良罗氏培养 江金华广福医院等提供；结核分枝杆菌H R 、鸟分 基上各接种0．1 ml，37t2孵育，每周观察1次，快速 枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝 生长非结核分枝杆菌1周内可生长菌落，慢生长分 杆菌和龟分枝杆菌脓肿亚种，由中国医学细菌保藏 枝杆菌4周报告结果。PNB和TCH两种鉴别培养 管理中心提供。 基上均生长为非结核分枝杆菌，两种鉴别培养基上 2．试剂