宋存江《生物技术概论》2.基因工程---新.pptVIP

2. 基因工程;2.1 基因工程概况 2.1.1基因工程的基本含义 按照人们的愿望（人为的），进行严密的设计（类似工程设计），通过体外DNA重组（非生命活动过程）和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短的时间内趋于完善（区别于自然突变和常规育种），创造出更符合人们需求的新的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。; 2.1.2 基因工程的主要理论依据 不同基因具有相同的遗传物质(DNA/RNA) 基因是可以从DNA上切割下来的 基因是可以转移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的(绝少数除外) 可以通过DNA复制把遗传信息传递给下一代;2.1.3 基因工程研究的基本技术路线;2.1.4 基因工程突出的优点 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限 可以使原核生物与真核生物之间的遗传信息进行相互重组和转移 可以使动物与植物之间的遗传信息进行相互重组和转移 可以使人与其他生物间的遗传信息进行相互重组和转移; 2.2.1 DNA 2.2.1.1 DNA的组成和结构;碱基有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4种。脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键连接。多个脱氧核苷酸按此方法连接成多聚脱氧核苷酸，其一端为游离的5′-磷酸基(5′-P)称为5′端；另其一端为游离的3′ -羟基(3′-OH),称为3’端。;基因工程 2.2.1.1 DNA的组成和结构; DNA的双螺旋结构 DNA两条脱氧核苷酸链总是按照碱基A与T互补配对和G与C互补配对的，通过氢键形成稳定的双螺旋结构，称为双链DNA。 少数病毒和噬菌体中的DNA是以单链形式存在的。;; 2.2.1.2 DNA的功能 （1）DNA分子能在细胞内复制 以原有的DNA链为模板，从特定的复制起始位点 （ori）起始，复制出新的DNA链。 （2）DNA是基因的主要携带者 一个基因是DNA分子上的一个特定的核苷酸序列。 ;基因工程 2.2.1.2 DNA的功能; 原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列 Pribnow框或-10区： -4 ~ -13bp之间由６个核苷酸组成，多数是TATAAT序列。 -35区：-35bp前后保守的TTGACA序列。;; ;2.2.2.1 限制性内切核酸酶和DNA片段化 限制性内切核酸酶(restriction endonuclease) 功能：能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并在合适的反应条件下,使每条链的一个磷酸二酯键断开,产生具有3′-OH和5′-P的DNA片段。 命名：HindIII由Haemophilus influenzae Rd中属名的H,种名的in 和菌株代号的d组成, III表示从此菌株中提取的第三种限制性内切核酸酶。 识别序列规律：旋转对称或左右互补对称。 切割位点:在识别序列上使磷酸二酯键断开的位置。 ;限制性内切核酸酶识别序列、酶切位点和酶切片段末端;限制性内切核酸酶的切割方法: 单酶切法 双酶切法 完全酶切法 部分酶切方法;2.2.2.2特异性DNA片段的PCR扩增 特点：体外高效扩增特异DNA片段。一个待扩 增的DNA片段，在3h内可扩增出约106 个这样的DNA片段。 关键因子： ※ 耐热性DNA聚合酶 ※引物 ;反应过程： ※ 反应系统加热至90~95℃, 底物双链DNA变性成为两条单链DNA； ※ 降温至37~60℃,使引物与模板DNA链互补序列杂交 ( 复性 )； ※ 升温至70~75℃，耐热性DNA聚合酶催化引物按5′→3′方向延伸, 合成模板DNA链的互补链。 ※ 重复以上过程，一般经过25～30次循环片段。 ;基因工程 2.2.2.2特异性DNA片段的PCR扩增; PCR反应五要素;5?;Cycle 3;after 25 cycles, amplification = 225 ~ 1 x 106 fold after 45 cycles, amplification = 245 ~ 3.5 x 1012 fold;(2)耐热性DNA聚合酶 在使靶DNA变性的高温下仍保持活性。 (3)PCR引物 引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补，并能引导模板DNA互补链合成的一种脱氧核苷酸寡聚体，3’端必须具备游离的-O