乳品中3种常见细菌多重PCR检测方法的建立.pdfVIP

E圃噩噩跚跚 DOI: 10. 13995/j. cnki. 11 -1802/ts. 201507027 乳晶中 3 种常见细菌多重 PCR 检测方法的建立* 闰晗1 ，吕国钦1 ，张洋2 ，张笑婿l ，冯旭1 ，王丽威I 1(辽宁工程技术大学理学院，辽宁阜新，123000) 2( 本溪市食品药品检验所，辽宁本溪，117000 ) 摘 要 分别以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌标准株为样本，提取其 DNA ，以大肠杆菌的 phoA 基因、金 黄色葡萄球菌的 nucA 基因和沙门氏菌的 invA 基因作为靶基因，建立可以同时检测这 3 种菌株的多重 PCR 方 法。与国标法对照，探讨多重 PCR 技术检测乳品样品中 3 种细菌的灵敏性和特异性。结果表明，建立的多重 PCR 检测方法与国标法检测的结果一致，人工模拟试验结果稳定，多重 PCR 具有快速、敏感和特异性强的特点。 关键词 乳品;多重 PCR; 大肠杆菌;金黄色葡萄球菌;沙门氏菌 球菌(ATCC 6538) 和肠炎沙门氏菌(ATCC 13076) 均 沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是乳与乳制品中的 常见致病菌[1] ，大肠杆菌是条件致病菌，广泛存在于 购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 。摘 自然界中，常被作为卫生监督的指示菌[2] 。传统的 疾志贺氏菌、普通变形忏菌、蜡样芽胞杆菌、白色葡萄 球菌、单核增生李斯特氏菌，均由中国科学院沈阳生 微生物检测和鉴定方法依赖于分离培养、生化试验和 态研究所惠赠。所有菌株接种于牛肉膏蛋白陈斜面 血清学鉴定，具有培养时间长和操作繁琐等缺陷。目 培养基，37 c培养 18 h ，转接 3 次后备用。 前，一些快速检测技术被应用于乳制品的微生物检验 生牛乳、巴氏乳、灭菌乳、炼乳和奶粉均购自当地 中，如利用流式细胞计数法检测乳品中的细菌总 数[3] 、应用酶联免疫吸附法检测是否存在某种微生 超市。新鲜乳品经无菌操作分装于冻存管，于 -20 c 物[4) 、以及与 PCR 技术相结合的免疫磁珠吸附与荧 冰箱中保存。 1. 1. 2 试剂与仪器 光定量 PCR 联合技术和环介导等温扩增技术快速检 测乳品中的致病菌(5 -1] 。虽然这些快速检测法具有 TaKaRa ExTaq 、 10 x PCR buffer 、 dNTP 混合物、 MgCl D口000 DNA Marker ，大连宝生物公司;PCR 和 敏感、快速和简单的优点，却存在每次只能检测一种 2 病原菌的弊端。多重 PCR (Multiplex PCR) 是在同一 引物由大连宝生物公司合成;琼脂糖(Sigma) 、榕菌 酶、蛋白酶 K 和 Tris-饱和酷，沈阳联星公司;三经甲 个反应体系中加入多对引物，能够同时扩增出多个目 基氨基甲皖(Tris) 、乙二胶四乙酸二饷( EDT