ch3细胞的破碎与分离2.pptVIP

第一节 细胞破碎技术 一、细胞破碎技术 二、几种常见的破碎方法： (一)高压匀浆法（High pressure homogenization） 2.细胞破碎率：属于一级反应速率方程 S:细胞破碎率 K:破碎速度常数 (破碎的阻力) P:操作压力 N:循环操作次数 a、b指数因细胞种类和培养条件而异 总之：微生物形态（morphology）和生理状态（physiology）决定了细胞的机械强度，破碎的参数Rmax、k、a、b、ρ等，随细胞种类和培养条件的不同而有所差异。如指数a 4、适用范围: 适用于酵母和大多细菌细胞的 破碎,不适用于…… 细胞悬浮液与极细的研磨剂（D＜1mm的无铅玻璃珠）在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间，珠子与细胞之间互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。 k 为破碎速率常数，主要与微球粒径、密度、填充率以及细胞浓度、搅拌速度、进料速度、搅拌浆的形状有关。（影响因素） （四）超声波破碎（ultrasonication） 1、机理： 2、影响因素： 3、适用范围： 不足： 易引起生化物质的变性，须在低温下操作，带来分离、回收化学试剂 的问题。如苯、甲苯、抗生素、SDS、EDTA、变性剂（盐酸胍脲）等化学药品可改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物质选择地渗透出来这种处理方式称为化学渗透法自溶作用。 2．酶溶法（Enzymatic lysis）： 常用的酶有溶菌酶→ 革兰氏阳性菌胞壁的分解；对于革兰氏阴性菌胞壁的分解则需加EDTA螯合剂，以除去脂多糖层中的钙离子，破坏其稳定性，然后溶菌酶才能分解胞壁。 使用时注意事项: 不足（存在的问题）: 四、选择破碎方法的依据 在固—液分离中细胞碎片的大小是重要因素，太小的碎片很难分离除去，因此，破碎时既要获得较高的产物的释放率又不能使细胞碎片太小。适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率，低的能耗和便于后步提取这三方面来权衡。 第二节 破碎技术研究的方向 1、多种破碎方法相结合： 化学法与酶法取决于细胞壁的化学组成。机械法取决于细胞结构的机构强度，而化学组成又决定了结构的机械强度，组成的变化必然影响到强度的差异，这就是化学法或酶法与机械法相结合的原理。 第三节 破碎率的测定 二、包涵体的分离和蛋白质的复性一般工艺路线： 　 细胞破碎 　　　离心 细胞→ → → 胞匀浆液 →→→包涵体 　 变性剂 　　　　　　　　　　 除变性剂 天然构型←← 表达产物 ↓←←←溶解包含体 的表达产物 再折叠 （可用透析或超滤 　　　 或直接稀释） 　　　　　　　　　　　 或电渗析 ①低蛋白质浓度,有利于获得较高的复性收率。 　②变性剂主要用6～8mol/dm3的盐酸胍(GuHcl)或脲。 ③用透析、超滤或电渗析除去变性剂。 ④有时包涵体中蛋白质含有两个以上的二硫键,其中有可能发生错误连接,所以在复性前先加还原剂,切二硫键,如β-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽。复性时，加氧化剂（如谷胱甘肽、半胱氨酸等） ⑤包涵体中蛋白质的复性率非常低,一般不超过20%～40%, 原因是变性剂浓度降低后，变性的蛋白质易发生聚集，甚至形成不可逆的变性沉淀。 本章小结 * * Chapter 3 Cell Disruption 第三章 细胞破碎 JJ-2组织捣碎匀浆机 2. Ultrasonication 超声波 超声波破碎仪 WSK卧式高效全能珠磨机 3. Crushing in ball mill 珠磨法 ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机 破碎方式（是否受外加作用力） 机械破碎法 非机械破碎法 固体剪切 液体剪切 高速珠磨法 高压匀浆法 超声波 溶胞作用 脱水作用 真空干燥 空气干燥 冷冻干燥 溶剂干燥 物理的 化学的 酶的 渗透压冲击 冻结融化法 阴阳离子 抗生素等 溶菌酶等 由高压泵和匀浆阀组成。从高压室（几百个大气压）压出的细胞悬浮液经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙喷出，速度可达几百米每秒，这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出，细胞在高速造成的剪切力、碰撞力和高压到常压的变化等作用下，造