DNA合成误差校正.ppt

Error correction in gene synthesis technology Trends in Biotechnology March 2012, Vol. 30, No. 3 基因的合成通常是用酶组装通过化学方法合成的寡聚合甘酸，合成的结果不可避免的出现缺失、插入和碱基替换等情况，基因合成的保真度是确保基因正确表达的首要条件，在自然条件下，不管原核还是真核生物其合成基因的错误率一般在1/107左右，而我们人为的基因合成其错误率一般在1/102左右. 本文介绍了一些基因合成过程中校正技术。 1) 合成寡核苷酸过程中的错误删除。 2) 合成基因过程中的错误删除。 2.1) 用 MutS 错误不协调绑定蛋白消除错误。 2.2) 用不协调切断酶校正错误。 目录 亚磷酰胺法示意图 合成流程 1） 1） 主要错误的形式： 第一、亚磷酰胺单体没能结合到延伸链上， 导致出现缺失出现，出错率在1.5%~0.5%左右。 第二、尚未耦合的链被乙酰化而终止反应， 导致提前终止合成，出错率在0.5%左右。 第三、第二步合成过量的催化剂会导致DMT 脱保护，然后再结合一份子亚磷酰胺而导致 插入的出现，出错率在0.4%左右. 1） 错误的排除方法 用HPLC和PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳） 通过长度大小的不同对其进行纯化。疏水的净化筒可以对尚未脱去DMT保护基的Oligos进行纯化，用这两种方法可以除掉90%的杂质（大部分是插入、删除和切断）。 缺点是：人力劳动量太大，而且没办法除去碱基替换和单个碱基的插入或删除。 2) 尽管对Oligos 经过了繁琐的纯化还是有一部分错误会随着Oligos进入下游的合成中，而且在聚合酶的延伸过程中也会引入一些新的错误，例如错配等。选择一个正确无误的基因序列经常要用到克隆测序的方法，此外表达分析和functional screens 也经常用于检查基因的正确与否，但是这种方法只对蛋白的编码区域有效，对其他不表的区域无效。 2) 对于长链DNA的合成一般是通过合成长度小于1kb的BB，测序正确之后再把BB连成长的基因.下面介绍一大类在基因合成过程中排除错误的方法：用 MutS 错误不协调绑定蛋白消除错误； 用不协调切断酶校正错误。作用机理如图所示 2) 2.1） MutS 蛋白是一种细菌的 MutHLS 错配修复器的一部分，它能够识别并绑定各种错配碱基。在变性和再次退火之后，错误包含在异源双链核酸分子中，用 MutS 蛋白把含有错误的链给绑定，通过凝胶电泳来分离。这种方法经一次处理能使错误减小到1/3.5kb，其缺陷是需要其自身大量双联是正确无误的。对于错误多的可以采用以下方法，这种方法叫consensus shuffling, DNA经过退火后，加入限制性内切酶的混合物，然后加入到固载有MutS 蛋白的筒形过滤器中，洗脱再做一个菌落PCR即可消除错误。 MutS 错误不协调绑定蛋白消除错误 核酸内切酶 2.1） 2.2） 用不协调切断酶校正错误 不协调切断酶是说一类能够在异源双链核酸分子中识别和切断错配序列的限制性内切酶，它可以分为三类： 第一类是游离酶，例如：噬菌体T4内切酶VII，T7内切酶I，大肠杆菌核酸内切酶V；第二类是错配修复核酸内切酶MutH ；第三类是单链特异性核酸酶，例如：S1核酸酶，P1核酸酶，绿豆核酸酶，CEL核酸酶。 游离酶的作用机制： The reannealed heteroduplexes are cleaved in both strands by mismatch-specific enzymes 2–5 bp downstream of the mismatches, generating stagger ends that are immediately dissociated at the reaction temperature. The single-stranded overhangs that contain mismatch bases are degraded by an exonuclease in the reaction mixture. Full-length genes with fewer errors are recovered by overlap assembly PCR 错配修复核酸内切酶MutH 大肠杆菌的MutH, MutL 和MutS 蛋白构成的细菌错配修复机制：首先是 MutS 检出并绑定错配碱基和 single-strand loops，然后 MutH 和 Mu