针灸治疗胃溃疡蛋白质组学效应研究平台技术优化与策略研究论文.docVIP

　　针灸治疗胃溃疡蛋白质组学效应研究平台技术优化与策略研究论文 杨波，高洋，张燕，严兴科 【摘要】 目的为开展针灸治疗胃溃疡的蛋白质组研究，建立并优化其蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术，提高其分辨率及重复性。方法对醋酸型胃溃疡大鼠进行针刺后取其胃部溃疡处组织，对组织蛋白质的提取方法进行改进，优化双向凝胶电泳的关键因素与环节.freelensinnal electrophoresis，2-DE)。②蛋白序列的鉴定。常用质谱仪鉴别出多维色谱和2-DE等分离出的差异蛋白是一已知蛋白，还是一新蛋白［1～3］。2-DE建立于1975年，三十余年的应用和发展使其技术渐于成熟，故在多维色谱出现后，2-DE仍被广泛采用，它是蛋白质组研究的基础，亦是当代研究的关键技术。 胃溃疡是一种世界性的常见病，人群中患病率高达5%～10%，亦有报告推测，每5名男人和10名女人中，可能有一人在他们的一生中患过本病，本病严重地危害了人们的健康［1］。针灸治疗本病取得了较好的疗效，并具有简便、经济、安全、并发症发生率低和不易复发等优势，但目前对于针灸治疗胃溃疡的疗效机制尚不清楚。运用蛋白质组学思维，以2-DE为技术手段研究针刺对醋酸型胃溃疡大鼠胃组织匀浆蛋白的影响，将有助于全面、真实地揭示胃溃疡发生的病理过程以及针刺治疗本病的效应机理。 1 材料与仪器 1.1 动物 P3 多功能微型垂直板电泳系统(Bio-Rad)、PROTEAN II xi Cell垂直板电泳系统(Bio-Rad)、Po IPG3-10预制胶条、尿素、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(Iodoacetamide)、丙乙酰胺（Acr, A.R.）、N,N甲叉双丙乙酰胺（Bis，A.R.）、40%载体两性电解质(Bio-Lyte 3/10 ampholytes)、矿物油(Minal Oil)以上试剂均来自美国Bio-Rad；两性去垢剂CHAPS、四甲基乙二胺（TEMED, A.R.）、过硫酸胺（APS, A.R.）、十二烷基硫酸钠（SDS, A.R.）以上试剂均来自AMRESCO；低溶点琼脂糖(Agarose, Promega)、三羟甲基氨基甲烷（Tris, A.R., BM）、氨基乙酸（Glycine, A.R., BM）、丙三醇(Glycerin, A.R., 上海化学试剂有限公司)、考马斯亮蓝R-250(CBB,.freelg组织，加入2.0 ml细胞裂解液（8 mol/L的尿素，4%的CHAPS，100 mmol/L的DTT，40 mmol/L的Tris-base和0.5%的两性电解质），在冰水混合物中以1 500 r/min仔细制备匀浆，反复冻融3个循环，加入20 μg/ml DNase I 10 μl和5 μg/ml RNase A 10 μl，在冰浴中1 500 r/min匀浆10 min。转移至离心管，4℃作用15 min后，以15 000 r/min离心30 min，收集上清液即为蛋白质粗提物，-80℃冷冻保存待用。 2.3 样品浓度测定Bradford法［4］。 2.4 双向电泳 2.4.1 第一向固相pH梯度(IPG)等电聚焦参照Gorg A等［5］的方法略有改动。取上述蛋白质样品，按1 mg的上样量计算出蛋白质上样体积，依该体积加入蛋白质样品，加入样品缓冲液至终体积300 μl，在液体涡旋仪及手掌型离心机上分别混匀。取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17 cm pH 3～10），室温中放置10 min。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。将样本均匀加入胶槽中，胶面向下放入17 cm IPG干胶条，胶条的正极对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，避免气泡产生，然后滴加覆盖矿物油3ml，需缓慢地一滴一滴将矿物油加在胶条的塑料支撑膜上。对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置程序。自动程序电泳参数设置见表1。表1 等电聚焦的程序（略） 2.4.2 平衡等电聚焦后迅速取出IPG 胶条，在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。将胶条胶面朝上转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，并加入10 ml平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上平衡15 min。第1次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用润湿的滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，将胶条胶面朝上转移至加有平衡缓冲液II的溶涨盘中, 继续在水平摇床上缓慢摇晃15 min。第2次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用润湿的滤纸吸取多余的平衡液。将IPG胶条从样品水