骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学鉴定.pdfVIP

第27卷第6期 赣 南 医 学 院 学 报 ％f．27ⅣD．6 2007年12月 JOURNAL OF GANNAN MEDICAL UNIVERSITY D C．2007 骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学鉴定 甘凤英 ，肖丽霞 ，陈彬娟 ，叶德富 (1．赣南医学院第一附属医院风湿免疫科；2．赣南医学院第一附属医院内分泌科，江西 赣州 341000； 3．江西省莲花县人民医院，江西 莲花 337100；4．福建医科大学第一附属医院风湿科，福建 福州 350006) 摘 要：目的：建立体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法，描述MSCs的生物学特征，探索 MSCs作为组织工程种子细胞的可行性。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法，分离纯化大鼠MSCs。利用 流式细胞仪检测细胞表面标志物CDI4、CD29、CD34、CIM5、CD105的表达率。取第4代MSCs进行成骨、成脂肪、 成软骨诱导分化，观察细胞的形态变化情况，在诱导第14d进行茜素红染色和油红染色以检测MSCs是否分化成 骨和脂肪细胞；在诱导第21d用阿新蓝染色法检测MSCs是否分化成软骨细胞。结果：从骨髓分离获得的MSCs 为体积小、核浆比大、呈旋涡状生长的梭形细胞。第3代细胞表面标记物阳性率分别为CD14：0．67％，CD29： 94．5％，CD34：0．72％，CD45：0．39％，CD105：86．36％。MSCs在相应的诱导条件下，分化成骨、脂肪、软骨细胞。 结论：密度梯度离心结合贴壁培养法可分离出较纯的MSCs，经扩增培养后获取足够数量的MSCs，能满足组织工 程的需要。MSCs具有多向分化的潜能，可在体外诱导分化成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，具有广阔的应用前 景。 关键词：骨髓问充质干细胞；软骨；骨；脂肪 中图分类号：Q2—33 文献标识码：A 文章编号：100l一5779(2007)06—0837—03 间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs) 液1次，除去非贴壁细胞。每日在倒置相差显微镜 是一种广泛分布于人体内的中胚层来源的未分化细 观察并记录原代细胞生长情况。待细胞80％融合 胞。该细胞在适当的环境中可诱导分化成软骨细 后，用0．25％胰蛋白酶＼O．02％EDTA消化传代。 胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞甚至神经元等多 1．2．2 细胞表面标记物的检测 用0．25％胰酶＼ 种细胞。骨髓中的MSCs更是具有取材方便、体外 0．02％EDTA消化收获第3代细胞，与饱和浓度的 易分离扩增，这些细胞特性稳定，可连续传代培养和 抗 CD14一FITC、CD29一FITC、CD45．FITC、CD34．PE、 冷冻保存后仍保持多向分化潜能等特点，是组织工 CD105·FITC单克隆抗体及其同型对照混匀，室温下 程的理想种子细胞，有望用于修复晚期骨关节炎、类 闭光反应20rain，PBS洗涤细胞，行流式细胞仪检 风湿关节炎患者缺损的关节软骨。 测，EXPO32．V1．2软件分析。 1．2．3 骨髓间充质干细胞向骨、脂肪、软骨分化的 1 材料与方法 潜能 将4代细胞以1×10。／孔接种至预置无菌盖 1．1 材料 DMEM培养基(Gibco公司)；TGF．131 玻片的6孔培养板中，培养24h后更换培养液，并将 (RD公司)；胎牛血清(杭州四季青生物公司)；3． 细胞培养分为4组：A组为空白对照组，每孔加入 异丁基一1．甲基黄嘌呤、吲哚美辛、转铁蛋白、茜素 I ml含10％胎牛血清的DMEM·LG培养基；B组为 红、胰岛素(均为 Sigma公司产品)；小鼠抗大鼠一 成骨分化组：10％胎牛血清 DMEM．LG培养基、 CD14·Frrc(Cahage公司