甲状腺激素对乳腺癌细胞中雌激素受体α和甲状腺激素受体β的影响.pdfVIP

《中国癌症杂志》2007年第17卷第12期 公司。甲状腺激素(T3)购自Sigma公司。2 X SyBr 过滤以去除生长因子和激素。细胞系由美国加州太 Green Master Mix购自ABI公司。 平洋医学中心Dr．Dairkee实验室馈赠。 1．1．2 细胞培养 细胞系MCF7、BT20在培养液 1．1．3 甲状腺激素(T3)刺激 当细胞在6孔培养 MEM+10％FCB；BT474、T47D在培养液RPMI1640 皿中达到70％覆盖度左右时，给予 10 mol／L的 +10％FCB；MDA-MB-231、MDA-MB-435在培养液 T3，每日1次，连续3 d，第4天经胰酶化后收集细 L15+10％FCB；SK-BR-3在培养液McCoy’S 5a+ 胞，提取总RNA。每个反应重复一次。 10％FCB，置于37 oC、5％CO 、饱和湿度细胞培养 1．1．4 引物设计 基因特异性引物采用软件Ap． 箱中培养。细胞培养液和血清在使用前均需活性炭 plied Biosystems Primer Express 1．5设计(见表1)。 表1 引物序列 Tab．1 Sequences of primers 1．2 方法 2 结 果 1．2．1 RNA提取和cDNA合成 根据RNAeasy试 剂盒说明书提取细胞总RNA。取5 g的RNA溶于 2．1 各乳腺癌细胞系中雌激素受体(ER·Ot)及甲状 30 l的RNAse-free水中，加入含30 U RNase-free 腺激素受体(TR·13)表达 实时定量RT-PCR结果 DNase(Roche)，5 X first-strand buffer(Gibco-BRL) 显示，在 MDA-MB-23 1、SK-BR-3、MDA-MB-435中 和20 U RNasin ribonuclease inhibitor(Promega)的反 ER—Ot表达量非常低(Ct值在30以上)，即一般意义 应液中，置37℃下40 min以除去基因组DNA。将 上的阴性表达(见图1A)。而T47D、MCF-7、BT20 该RNA中加入oligo(dT)primers(Sigma-Genosys) 和BT474中，ER． 表达水平显著高于前3种细胞 和random hexamers(Gibco-BRL)，每反应标本中各 系中的表达，呈阳性表达。同样由图1B可见，TR-p 加1 tzg，置于70℃下10 min。随后，该RNA中加入 在MDA．MB．231、SK．BR-3、MDA．MB-435中表达量 480 U 的 Superscript II RNase H-Reverse Tran- 非常低，而在T47D、MCF-7、BT20和BT474中明显 scriptase(Gibco-BRL)，0．5 mmol／L dNTPs(Pharma- 高表达。经过进一步分析提示，两者在7种乳腺癌 cia)和20 U的 RNasin ribonuclease inhibitor，置于 细胞系中的表达具有明确的相关性(见图1C)。 42℃下60 min，反应后调整cDNA浓度至10 ng／trl。 2．2 经T3治疗后各乳腺癌细胞系中ER·Ot、TR·13 1．2．2 Rea1．Time PCR 取50 ng的cDNA为模板 和RXR．Ot的表达 由图2可见，在ER． (一)乳腺 行实时定量PCR(ABI 5700型荧光定量PCR仪)。 癌细胞系中，T3导致了ER． 、RXR-Ot和TR-p水平 反应液为：15 trl SyBr Green Master Mix和330 nmol／ 上调，尤其是TR．p的水平上调了2倍或以上；相比 L上游和下游的引物。PCR反应参数为：95 oC预变 较，在ER．Ot(+)细胞系中未观察到该现象。 性10 min，95 oC变性15 S，65 oC退火1 min，35个循 2．3 SK．BR-3细胞中T3治疗所诱导的基因变化 环。 在ER． (一)的SK-B